CRISPR) nyaéta téknik ngédit génom generasi katilu: CRISPR ngarévolusi dunya

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) nyaéta téknik ngédit génom generasi katilu anu parantos ngarévolusi dunya kalayan hasil throughput anu luhur. Éta parantos dianggo pikeun ngubaran rupa-rupa panyakit biologis sareng inféksi. Rupa-rupa baktéri sareng prokariot sanésna (sapertos archaea) ogé gaduh sistem CRISPR / Cas9 pikeun ngajaga tina fag. Parantos dilaporkeun yén strategi berbasis CRISPR / Cas9 tiasa ngahambat kamekaran sareng kamajuan kanker payudara triple negative (TNBC) ku cara narékahan gén résistansi anu berpotensi robih, transkripsi, sareng régulasi épigenetik. Intervensi terapi ieu tiasa ngabantosan ngungkulan masalah anu nangtang sapertos résistansi ubar anu dititénan bahkan dina TNBC. Ayeuna, rupa-rupa metode dianggo pikeun nganteurkeun CRISPR / Cas9 ka sél target, sapertos fisik (mikroinjeksi, éléktroporasi sareng modeu hidrodinamik), virus (virus anu aya hubunganana sareng adeno sareng lentivirus) sareng non-virus (liposom sareng nanopartikel lipid). )-partikel). Sanaos rupa-rupa modél parantos dikembangkeun pikeun nalungtik panyabab molekuler TNBC, kurangna metode anu sénsitip sareng tertarget pikeun nganteurkeun alat panyuntingan génom in vivo ngawatesan aplikasi klinisna. Singkatna, ulasan ieu sacara komprehensif nalungtik kamajuan, tantangan, watesan, sareng prospek pangobatan CRISPR/Cas9 pikeun TNBC dumasar kana bukti anu aya. Kami ogé nyorot kumaha kombinasi kecerdasan jieunan sareng pembelajaran mesin tiasa ningkatkeun strategi CRISPR/Cas9 dina pangobatan TNBC.
Kanker dicirikeun ku pambagian sél anu teu dikontrol, gangguan titik pamariksaan siklus sél, sareng mutasi dina gén supresor tumor (TSG) (Matthews et al., 2022). Di antara rupa-rupa jinis kanker, kanker payudara mangrupikeun jinis kanker anu paling umum dina awéwé sareng gaduh tingkat mortalitas anu luhur di sakumna dunya (Waks sareng Winer, 2019). Kanker payudara mangrupikeun panyakit hétérogén kalayan ciri anu rupa-rupa, sapertos fitur histologis sareng biologis, presentasi klinis sareng paripolah, sareng réspon kana pangobatan (Weigelt et al., 2010). Klasifikasi kanker payudara nyayogikeun wawasan anu tepat pikeun diagnosis kanker payudara sareng prognosis tumor. Panggunaan biomarker umum sareng fitur klinikopatologis parantos janten kriteria utama pikeun klasifikasi kanker payudara (Tsang sareng Tse, 2019). Prognosis sareng réspon kana pangobatan kanker payudara dipangaruhan ku sababaraha faktor, kalebet ayana reséptor éstrogén (ER), reséptor progesteron (PR), reséptor faktor pertumbuhan épidermal manusa 2 (HER2/neu), sareng tingkat histologis, jinis tumor, sareng tingkat. ukuran sareng metastasis kelenjar getah bening (Al-Tubaiti, 2020). Lima subtipe molekuler intrinsik kanker payudara parantos diidentifikasi, kalebet luminal A, luminal B, HER2-enriched, basal-like, sareng claudin-low (Prat et al., 2015). TNBC mangrupikeun subtipe molekuler kanker anu henteu ngébréhkeun sadaya ER, PR, sareng HER2 (Yin et al., 2020). Fitur patologis ieu aya hubunganana sareng TNBC, anu mastikeun kamajuanana anu gancang sareng sipat anu langkung agrésif tibatan jinis kanker payudara anu sanés (Feng et al., 2018). Salaku tambahan, Peru et al (2000) nganggo téknologi microarray pikeun ngaklasifikasikeun deui kanker payudara sareng ngaidentipikasi lima subtipe intrinsik kanker payudara (Cadenas, 2012). Kanker payudara basal-like mangrupikeun subtipe kanker payudara anu gaduh fenotipe triple-negatif sareng aya hubunganana sareng kamajuan anu gancang. Perlu dicatet yén sadaya kanker payudara basal-like umumna salah didiagnosis salaku TNBC, tapi ngan ukur 77% anu TNBC; Sabalikna, 71–91% TNBC téh siga basal, nunjukkeun yén dua jinis kanker payudara ieu tumpang tindih sareng ngawakilan klasifikasi anu béda (Wang D.-Y. et al., 2019). Ieu nyiptakeun kabutuhan pikeun ngacirikeun hétérogénitas TNBC pikeun ngajelaskeun prognosis sareng ngaidentipikasi réspon poténsial kana pangobatan ayeuna sareng ka hareup. Salaku tambahan, TNBC nyumbang 15–20% tina sadaya kasus kanker payudara sareng langkung umum dina awéwé di handap umur 50 taun. Mutasi BRCA1 atanapi BRCA2 parantos dilaporkeun dina sakitar 20% kasus TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Panilitian ogé nunjukkeun yén TNBC gaduh lingkungan mikro imun anu béda anu kalebet tingkat faktor pertumbuhan endotel vaskular anu luhur, makrofag anu aya hubunganana sareng tumor (TAM), limfosit anu nyusup kana tumor (TIL), sareng molekul sanés anu kalibet dina pertumbuhan sareng migrasi tumor. Ku kituna, ngartos lingkungan mikro TNBC penting pisan pikeun prognosis sareng pangobatanana (Fan sareng He, 2022).
Pikeun meunteun prognosis TNBC sareng mastikeun pangobatan anu efektif, diagnosis anu akurat, utamina dumasar kana imunohistokimia (IHC) pikeun ngadeteksi ER, PR sareng HER2, sareng mamografi pikeun ngadeteksi neoplasma payudara, penting pisan. Nanging, mamografi henteu tiasa ngagambarkeun sacara nyukupan fitur intratumoral sapertos nekrosis sareng fibrosis (Deepak Singh et al., 2021). Kusabab prognosis sareng diagnosis anu goréng nyegah dokter pikeun ngaresepkeun ubar anu leres (Chaudhary, 2020), rupa-rupa strategi dianggo pikeun ningkatkeun perawatan pikeun pasien TNBC. Ayeuna, dua ubar, doxorubicin sareng siklofosfamid, dianggo dina pasien TNBC sareng parantos nunjukkeun hasil anu saé. Salaku tambahan, ubar platinum sanés dianggo, sapertos carboplatin sareng cisplatin (Sikov et al., 2015). Salaku tambahan, inhibitor PARP sapertos Olaparib, Velaparib, sareng PF-01367338 parantos dianggo salaku ubar kemoterapi poténsial pikeun pangobatan TNBC (Ishino et al., 2018). Kusabab jalur sinyal Wnt/b-Catenin, NOTCH, sareng Hedgehog parantos dilaporkeun kalibet dina kajadian sareng kamajuan TNBC, narékahan ubar kana jalur ieu tiasa janten strategi anu penting (Aysola et al., 2013). Sanaos operasi, terapi radiasi sareng kémoterapi tetep janten andalan pangobatan pikeun TNBC ayeuna, kamajuan anu signifikan parantos dilakukeun dina ngembangkeun pangobatan énggal kalebet terapi anu dituju, imunoterapi, rupa-rupa alat panyuntingan gén anu aya hubunganana sareng CRISPR sapertos Cas9n, dCas9., CRISPR/Cas12, panyuntingan utama, sareng terapi gén anu ditujukeun ku CRISPR/Cas9. Di dieu urang bakal fokus kana rupa-rupa alat panyuntingan gén anu aya hubunganana sareng CRISPR anu dianggo dina pangobatan TNBC. Di antarana, CRISPR/Cas9 parantos nampi perhatian anu lega.
Cas9n, ogé katelah Cas9 nickase, nyaéta varian protéin Cas9 anu direkayasa sacara genetik anu diturunkeun tina sistem éditing génom CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Dina bentuk aslina, protéin Cas9 ngandung dua domain nuclease: RuvC sareng HNH, fungsi utama nyaéta meulah dua untaian DNA. Nanging, dina Cas9n, salah sahiji domain nuclease, HNH, dimutasi sacara genetik sareng janten teu aktip. Ku alatan éta, domain HNH Cas9n tetep teu fungsi. Ngan domain RuvC anu tetep aktip, anu ngamungkinkeun Cas9n pikeun motong atanapi nyiptakeun pegatna dina untaian DNA tunggal (Trevino sareng Zhang, 2014). Dibandingkeun sareng Cas9, Cas9n tiasa sacara efektif ngirangan épék anu teu dihoyongkeun sareng ningkatkeun mékanisme perbaikan sél sacara akurat. Cas9n tiasa dianggo pikeun ngarengsekeun rupa-rupa masalah, sapertos nyiptakeun pegatna di lokasi khusus dina DNA untaian ganda. Pikeun tujuan ieu, dua molekul Cas9n digabungkeun sareng dianggo babarengan (Yee, 2016). Kinase garis keturunan campuran 3 (MLK3) nyaéta protéin kinase anu diaktipkeun ku mitogen anu janten régulator konci salami metastasis TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 tiasa ngaktipkeun sababaraha jalur sinyal anu ngarah kana metastasis TNBC. Salaku conto, jalur c-Jun N-terminal kinase (JNK) ngatur motilitas sél sareng degradasi matriks ékstrasélulér, sareng MLK3 ngaktipkeun jalur JNK, ku kituna ningkatkeun motilitas sél sareng masihan sipat invasif (Rattanasinchai sareng Gallo, 2016). MLK3 ogé ngatur EMT. Pikeun ngalakukeun ieu, éta ngaktipkeun faktor transkripsi hilir sapertos Snail, Slug sareng Twist. Faktor-faktor ieu ngahambat éksprési spidol épitél sareng ngamajukeun éksprési spidol mesenchymal, anu ngarah kana akuisisi fenotipe métastatik (Casalino et al., 2023). MLK3 parantos dititénan maénkeun peran dina remodeling ECM sareng aktivasi protéase sapertos matrix metalloproteinases (MMPs) anu ngadegradasi ECM. Ieu ngagampangkeun invasi sél tumor sareng nyebarkeun ka tempat anu jauh (Katari et al., 2019). Ku kituna, panilitian sateuacana parantos nunjukkeun yén MLK3 maénkeun peran penting dina TNBC. Rattanasinchai sareng Gallo nganggo modél TNBC pikeun nalungtik peran MLK3 sareng mendakan yén éta ngamajukeun kamekaran kanker ngalangkungan jalur sinyal khusus. Aranjeunna nganggo CRISPR/Cas9n pikeun ngédit MLK3 sareng niténan réduksi anu signifikan dina metastasis TNBC (Rattanasinchai sareng Gallo, 2016).
dCas9, anu sering disebut Cas9 anu teu aktip, nyaéta bentuk turunan protéin Cas9 anu dimodifikasi. Teu siga Cas9 anu aktip, dCas9 kakurangan aktivitas endonuklease, janten teu tiasa ngainduksi pegatna untaian ganda DNA. Ku alatan éta, dCas9 tiasa dianggo pikeun narékahan sacara tepat daérah génom anu khusus tanpa aya parobahan atanapi modifikasi kana runtuyan DNA (Wang et al., 2016). Dina dCas9, dua protéin endonuklease, RuvC sareng HNH, diinaktivasi ku cara ngurangan résidu asam amino anu penting. (Richter et al., 2016). Sanaos kurangna aktivitas pamotongan DNA, dCas9 maénkeun sababaraha peran penting dina panalungtikan genetik sareng biotéhnologi. Salaku conto, éta ngamungkinkeun visualisasi daérah génom anu khusus, ngagampangkeun régulasi transkripsi, sareng ngamajukeun modifikasi épigenetik (Brocken et al., 2018).
Faktor transkripsi ZEB1 (singgetan ramo séng E-box homeobox 1) maénkeun peran anu khusus sareng penting dina ngamediasi transisi épitél-mesenkim (EMT), prosés sélular anu lumangsung nalika kamekaran émbrionik, perbaikan jaringan, sareng kamajuan kanker. Ieu ngalibatkeun transformasi sél épitél kana sél mesenkim, anu ngahasilkeun parobahan dina morfologi sél, motilitas, invasi, jsb. (Wu et al., 2020). ZEB1 ngahambat sababaraha spidol épitél, sapertos E-cadherin sareng Occludin, anu tanggung jawab pikeun ngajaga adhesi sél-sél sareng polaritas sél épitél dina TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Salaku tambahan, ZEB1 ngaktipkeun spidol-spidol tertentu sapertos N-cadherin, vimentin sareng fibronectin (Konradi et al., 2014) sareng ogé ngatur gén anu kalibet dina remodeling sitoskeletal sapertos Rho GTPases sareng matrix metalloproteinases (MMPs) (Huang). et al., 2014). 2022), sajaba ti éta, éta ogé mangaruhan rupa-rupa jalur sinyal sapertos transforming growth factor-β (TGF-β), sinyal Wnt, jsb., sahingga ngamajukeun invasi tumor sareng metastasis dina TNBC (Chen et al., 2016). ). Seueur panilitian sareng bukti ilmiah nunjukkeun yén ZEB1 gaduh poténsi anu ageung salaku agén anu berharga pikeun deteksi sareng intervensi terapi TNBC. Dina panilitian anyar, Waryah et al. nganggo modél TNBC sareng ngahontal panurunan lengkep ZEB1 ku dCas9. Ku kituna, aranjeunna niténan spésifisitas anu luhur pisan sareng inhibisi ampir lengkep ZEB1 dina kaayaan in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 nyaéta alat panyunting gén anu disebut CRISPR/Cpf1. Ieu asalna tina sistem CRISPR/Cas, dimana istilah Cas12 nujul kana protéin 12 anu pakait sareng CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), anu ampir sami sareng Cas9. Hiji-hijina bédana nyaéta ngandung protéin Cas12. Dibandingkeun sareng Cas9, Cas12 ngagaduhan sababaraha fungsi unik sapertos ngahasilkeun tungtung anu lengket salami prosés panyuntingan gén, sedengkeun Cas9 ngahasilkeun tungtung anu tumpul (Wang et al., 2021). Sipat Cas12 ieu nyumbang kana téknologi manipulasi DNA khususna. Salaku protéin anu sanggup mikawanoh sareng motong DNA target sacara tepat, éta ngagaduhan versatility anu luar biasa, jantenkeun alat anu efektif pikeun rupa-rupa aplikasi, kalebet panyuntingan gén (Pickar-Oliver sareng Gersbach, 2019).
Sarupa sareng varian CRISPR anu sanés, CRISPR/Cas12 ogé sanggup ngarecah atanapi ngaktipkeun gén dina TNBC, narékahan gén anu maénkeun peran penting dina patogenesis atanapi réspon kana pangobatan (Yang sareng Zhang, 2023). Pikeun ngalaksanakeun prosés ieu, RNA pituduh (gRNA) dikembangkeun anu ngarahkeun Cas12 ka gén target. Sakali Cas12 ngabeungkeut kana targetna, éta ngenalkeun putus untaian ganda dina DNA sareng ngaktipkeun mékanisme perbaikan DNA. Salila prosés perbaikan, nukléotida anu salah tiasa dilebetkeun, anu ngarah kana mutasi gén sareng kaleungitan fungsi (Zhang et al., 2021a). Salaku tambahan, vérsi anu ditingkatkeun tina énzim Cas12 (disebut dCas12) ogé dianggo pikeun ngaktipkeun gén. Ku ngagabungkeunana sareng aktivator transkripsi, dimungkinkeun pikeun ngainduksi gén-gén tertentu, sahingga ngaktipkeunana. Téhnologi ieu gaduh poténsi anu ageung dina ngamajukeun aktivasi gén supresor tumor (Sultan et al., 2022).
Éditing primér nyaéta téknologi éditing génom anu nembé dimekarkeun sareng unggul pisan. Ieu téknologi sanggup ngarobih DNA organisme kalayan tepat pisan (Chen sareng Liu, 2023). Éditing primér kahontal ngaliwatan integrasi dua komponén utama: énzim CRISPR/Cas9 anu dimodifikasi sareng transkriptase tibalik. Peran énzim CRISPR/Cas9 nyaéta pikeun sacara selektif narékahan situs anu tepat dina génom, sedengkeun transkriptase tibalik ngabantosan pikeun ngarobih DNA sacara saksama dina lokasi target (Hassan et al., 2021). Dina mékanisme éditing primér, léngkah munggaran ngalibatkeun nyiptakeun RNA pituduh éditing primér (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Ieu ngandung runtuyan target sareng citakan RNA anu saluyu sareng situs éditing anu dipikahoyong dina DNA target. PegRNA teras diwanohkeun kana sél target sareng nuklease éditing primér (PE2). PE2 nyaéta protéin fusi anu diwangun ku énzim Cas9, transkriptase tibalik, sareng adaptor éditing primér (Martín-Alonso et al., 2021). Di jero sél, kompleks pegRNA sareng PE2 milarian DNA khusus anu aranjeunna hoyong modifikasi. Énzim Cas9 motong DNA sareng nyiptakeun citakan anu diwangun ku untaian tunggal (Choi et al., 2022). Transkriptase terbalik nganggo citakan ieu pikeun nyiapkeun DNA pikeun diédit. Salian ti nyalin DNA, pitunjuk pikeun ngédit citakan RNA ogé kalebet. Pamungkas, untaian DNA anu nembé didamel dianggo salaku citakan pikeun ngalereskeun pegatna dina DNA, anu ngahasilkeun runtuyan DNA anu dirobih anu ngandung modifikasi anu dipikahoyong (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Mékanisme ngédit primer tiasa nyababkeun mutasi anu nyebar dina gén. Éta tiasa narékahan mutasi titik, sisipan, delesi, sareng bahkan panggantian gén (Anzalone et al., 2019; Chen sareng Liu, 2023). Éditing primer nawiskeun sababaraha kaunggulan dibandingkeun téknologi ngédit génom sateuacana. Ieu kalebet ningkatna akurasi, ngirangan épék anu teu dihoyongkeun, sareng kamampuan pikeun ngédit DNA tanpa ngandelkeun pegatna untaian ganda DNA (Anzalone et al., 2020).
Téhnologi CRISPR/Cas9 mimitina dikembangkeun pikeun ngajaga baktéri tina transfer plasmid sareng inféksi fag sareng engkéna dianggo deui salaku alat targeting DNA berbasis RNA anu efektif pikeun ngédit génom (Jiang sareng Doudna, 2017). Salian ti éta, sistem CRISPR/Cas9 parantos dilaporkeun aya dina 50% sareng 87% génom baktéri sareng archaeal, masing-masing (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 mangrupikeun alat poténsial pikeun ngahapus, nyelapkeun sareng ngabenerkeun runtuyan genetik anu teu normal nganggo modeu in vivo sareng in vitro (Sabit et al., 2021). Leuwih ti éta, CRISPR/Cas9 parantos dipidangkeun janten bagian tina sistem imun adaptif kusabab spésifisitasna pikeun gén target anu dipikaresep (Chen sareng Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 diwangun ku Cas9 sareng hiji RNA pituduh tunggal (sgRNA). Cas9 nyaéta endonuklease anu diwangun ku sababaraha komponén protéin. Salian ti éta, Cas9 ngagaduhan sipat struktural sareng konformasional anu unik (Pacesa et al., 2022) sabab diwangun ku dua lobus: pangakuan (REC) sareng nuklease (NUC). Lobus REC salajengna dibagi kana tilu daérah: REC1, REC2, sareng heliks sasak (Cromwell et al., 2018). NUC diwangun ku tilu lobus, nyaéta RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH sareng domain interaksi motif protospacer anu caket (PAM) (Gambar 1) (Song et al., 2016). sgRNA diwangun ku dua komponén, kalebet CRISPR RNA (crRNA) sareng transcoding RNA leutik (tracer RNA) (Gambar 1). sgRNA nyambungkeun protéin Cas9 ka koneksin pikeun ngabentuk kompleks aktif, ogé katelah kompleks efektor (Richter et al., 2012). crRNA nyaéta pasangan basa nukléotida 18–20 anu maénkeun peran penting dina mikawanoh runtuyan DNA target. Salian ti éta, crRNA dipasangkan sareng DNA target, sareng tracrRNA bertindak salaku perancah pikeun nuklease Cas9 pikeun ngabeungkeut DNA target (Manghwar et al., 2019). Di sisi séjén, runtuyan PAM ngagaduhan 3 nukléotida, anu mastikeun, nangtukeun sareng ngamediasi pangiketan kompléks efektor kana DNA. Subunit kompleks protéin Cas9 RuvC sareng HNH ngagaduhan aktivitas katalitik (Richter et al., 2012; Asmamaw sareng Zawdie, 2021). Domain nuklease HNH tina subunit Cas9 meulah untaian DNA anu aya hubunganana sareng crRNA. Domain nuklease RuvC meulah untaian DNA anu sanés sareng ngahasilkeun pegatna untaian ganda (DSB), saatos éta dua mékanisme perbaikan pegatna DNA anu béda diaktipkeun (Jiang sareng Doudna, 2017) (Gambar 1).
Gambar 1. Tinjauan CRISPR/Cas9 (A). Komponen sistem CRISPR/Cas9: (i). Éndonuklease Cas9 tanggung jawab pikeun motong runtuyan DNA target, (ii) hiji pituduh (sg) RNA hasil tina fusi crRNA sareng kimera tra-crRNA. (dua). Cas9 ngawengku sababaraha komponén sapertos Rec I, Rec II, lobus NUC (HNH sareng Ruv C mangrupikeun subkomponén) sareng domain interaksi PAM (C) kalayan fungsi anu saluyu. Kompleks protéin CRISPR/Cas9 meulah runtuyan DNA kana bentuk non-komplementer sareng komplementer (D). CRISPR/Cas9 ngédit génom dina tilu tahapan: pangakuan, motong sareng ngalereskeun. sg-RNA anu dirancang nungtun Cas9 sareng mikawanoh runtuyan anu dipikahoyong ngalangkungan komponén komplementer crRNA. Cas9 mikawanoh runtuyan PAM dina 5′-NGG-3′ sareng ngalemberehkeun DNA, ngabentuk hibrida DNA-RNA sareng ngaktipkeun pambelahan. Domain HNH Cas9 meulah untaian komplementer, sareng domain RuvC meulah untaian non-komplementer. CRISPR/Cas9 ngalereskeun dsDNA ku cara meulahna ku dua cara: non-homolog end joining (NHEJ) sareng homology-directed repair (HDR). NHEJ ngalereskeun DNA untaian ganda tanpa ayana DNA homolog asing ngalangkungan prosés énzimatik, mékanisme anu rawan kasalahan anu tiasa nyelapkeun atanapi ngahapus runtuyan DNA acak. HDR spésifik pisan sareng meryogikeun témplat DNA homolog.
Jalur perbaikan anu dimediasi ku CRISPR/Cas9 kalebet mékanisme non-homolog end joining (NHEJ) sareng mékanisme perbaikan anu diarahkeun ku homologi (HDR). NHEJ mangrupikeun jalur anu rawan kasalahan sabab ngalibatkeun penyisipan atanapi ngahapus sareng henteu meryogikeun pola naon waé salami mékanisme perbaikan. Éta nganggo nukléotida acak pikeun ngahasilkeun protéin standar (Abbasi et al., 2021). Sistem perbaikan ieu diwangun ku opat kompleks sapertos kompleks KU, kompleks protéin cross-complementing tipe 4 (XRCC-4), énzim pamrosésan tungtung DNA, sareng DNA-PKcs protéin kinase (Abbasi et al., 2021). Protéin kompléks KU mibanda dua subunit, Ku 70 sareng Ku 80, sareng maénkeun peran penting dina mékanisme NHEJ, sabab mékanisme perbaikan dimimitian ku beungkeutan dua subunit (Ku 70 sareng Ku 80) kana tungtung DNA target anu tumpul atanapi ampir tumpul (Abbasi et al., 2021), anu janten perancah pikeun ngarékrut faktor-faktor sanés anu aya hubunganana sareng NHEJ ka tempat tatu (Yang et al., 2020). XRCC-4 sareng DNA ligase diwangun ku 334 sareng 911 asam amino, masing-masing, sareng kompleks XRCC4-DNA ligase IV ngarangsang ligasi tungtung DNA (Chatterjee et al., 2015). Énzim pamrosésan tungtung DNA, ogé katelah polinukleotida kinase 3′-fosfat, nyaéta énzim pamrosésan tungtung DNA. Éta tiasa miceun gugus 3′P dina DNA sareng ngafosforilasi gugus 5′OH salami perbaikan DSB. Ieu ogé ngalibatkeun perbaikan pegat untaian tunggal (SSB) nganggo jalur perbaikan SSB (Chatterjee et al., 2015). Protein kinase DNA-PKcs nyaéta protéin kinase anu gumantung kana DNA anu diwangun ku subunit katalitik PIKK (kinase anu aya hubunganana sareng fosfatidilinositol 3-kinase) sareng kulawarga ataxia telangiectasia mutated (ATM), ogé ATR anu aya hubunganana sareng ATM sareng Rad3. pegat untaian (DSB) sareng pegat untaian tunggal (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR mangrupikeun mékanisme perbaikan anu langkung akurat sareng cocog sabab inpormasi disalin nganggo bentuk utuh tina dupleks DNA homolog, sanaos meryogikeun ayana kromatid sadulur. Ieu lumangsung salami fase S/G2 tina siklus sél mamalia. HDR utamina lumangsung dina spésiés ragi, tapi NHEJ penting pisan dina mamalia (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Mékanisme perbaikan lengkep dipidangkeun dina Gambar 1.
Kusabab TNBC disababkeun ku abnormalitas genetik sareng epigenetik, koréksi abnormalitas génomik/epigenomik ganas nganggo CRISPR/Cas9 tiasa janten pendekatan terapi anu wajar (Chen et al., 2019). Salian ti éta, sababaraha faktor transkripsi anu kalibet dina régulasi transkripsi spésifik sél tiasa nunjukkeun ciri unik sél kanker, nunjukkeun yén régulasi transkripsi tiasa janten pendekatan anu saé pikeun pengobatan kanker (Drost et al., 2017). Ngamangpaatkeun fitur molekuler tumor ieu, sapertos cacad genetik, epigenetik sareng transkripsi, pikeun pamekaran ubar tiasa ningkatkeun hasil klinis sareng ngirangan biaya panyaringan. CRISPR mangrupikeun alat panyuntingan gén poténsial anu henteu ngan ukur tiasa ngadeteksi sareng ngaidentipikasi target génomik anu nyababkeun kanker, tapi ogé tiasa dianggo pikeun ngédit, ngurangan, sareng ngarobih onkogen sacara epigenetik dina sél manusa (Tabel 1) (Ahmed et al., 2021). Sababaraha panyaringan CRISPR parantos dilakukeun pikeun milarian gén anu aya hubunganana sareng supresor tumor, onkogen, sareng résistansi ubar. Panggunaan CRISPR/Cas9 pikeun ngédit rupa-rupa onkogen TNBC dipidangkeun dina Gambar 2.
Gambar 2. Éditan gén tina rupa-rupa onkogen TNBC nganggo CRISPR/Cas9 anu ngahasilkeun panurunan kamekaran tumor sareng metastasis. Onkogen ieu kalebet CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 sareng CXCR7, Crypto1, ROR1 sareng ST8SIA, anu kalibet dina kajadian sareng metastasis TNBC.
Migrasi sél kanker, invasi, sareng transisi epitel-mesenkim (EMT) aya patalina sareng ITGA9. Panilitian sateuacana nunjukkeun yén ITGA9 mangrupikeun pamaén konci dina jalur Notch sareng maénkeun peran anu pikaresepeun dina metastasis rhabdomyosarcoma (Molist et al., 2020). Salian ti éta, ITGA9 kapanggih aya patalina raket sareng prognosis pasien dina sababaraha jinis tumor, kalebet kanker payudara (Wang Z. et al., 2019). Salaku tambahan, analisis bioinformatika ITGA9 nunjukkeun yén éksprési na dina TNBC sacara signifikan langkung luhur tibatan subtipe kanker payudara anu sanés. Kadar ITGA9 anu ningkat aya patalina sareng metastasis tumor sareng kambuh dina pasien TNBC. Knockout ITGA9 ku CRISPR/Cas9 nyababkeun sipat sapertos sél stém kanker (CSC), angiogenesis tumor, kamekaran tumor, sareng ngirangan metastasis ku cara ngamajukeun degradasi β-catenin dina TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 mangrupikeun anggota kulawarga TGF-β sareng penting pisan pikeun émbriogenesis awal, pangropéa sél stém, sareng metastasis kanker (Ishii et al., 2021). Ogé katelah Tdgf-1, éta mangrupikeun protéin sinyal GPI onkogenik anu diarahkeun kana régulasi formasi garis primitif, mesoderm sareng endoderm, ogé ngadegna asimetri kénca/katuhu dina kamekaran organ awak salami émbriogenesis (Zhang et al., 2021b). Salaku tambahan, Cripto-1 parantos dipidangkeun kalibet dina transisi épitél-mesenkim (EMT) salaku pananda sél stém (Zhang et al., 2021b). EMT penting henteu ngan ukur pikeun rupa-rupa prosés sapertos kamekaran émbrionik, fibrosis sareng penyembuhan tatu, tapi ogé pikeun invasi kanker sareng metastasis. Salaku tambahan, Cripto-1 parantos dipidangkeun berinteraksi sareng opat reséptor Notch sareng ningkatkeun pematangan pasca-translasi na (Brandstadter sareng Maillard, 2019). Jalur sinyal Notch dipikanyaho kalibet dina pangropéa sél kanker payudara manusa. Panilitian nunjukkeun yén knockout Crypto-1 anu dimediasi CRISPR/Cas9 nyegah kamekaran kanker sareng metastasis. Ku kituna, Crypto-1 tiasa janten target terapi anu penting pikeun TNBC (Castro et al., 2015).
Protéin XCL12 sareng reséptor kemokinna CXC (CXCR4 sareng CXCR7) maénkeun rupa-rupa peran dina proliferasi, kamekaran, migrasi sareng invasi sél kanker (Wu et al., 2015). Kemoreseptor ieu parantos dikaitkeun sareng kamekaran TNBC ngalangkungan sababaraha jalur sinyal dina modél in vivo sareng in vitro (Wu et al., 2015). Salaku tambahan, aktivasi CXCR4 sareng CXCR7 dikaitkeun sareng karentanan anu langkung ageung kana metastasis sareng prognosis anu goréng dina TNBC (Karn et al., 2022). Ku alatan éta, knockout CXCR4 sareng CXCR7 tiasa janten gén target ubar anu efektif pikeun pengobatan kanker payudara, kalebet TNBC. Panilitian ku Yang et al. Yang et al (2019) nganggo CRISPR/Cas9 pikeun nga-knockout gén CXCR4 sareng CXCR7 sareng mendakan yén proliferasi, kamekaran, migrasi sareng invasi TNBC dihambat sacara signifikan (Yang et al., 2019).
Kanaékan kadar miR-3662, hiji onkogen TNBC, katingali dina jaringan kanker payudara (Yi et al., 2022). Knockdown miR-3662 parantos kabuktosan ngahambat kamekaran tumor kanker payudara sareng metastasis boh in vivo boh in vitro (Agarwal sareng Gupta, 2021). HBP-1 mangrupikeun inhibitor anu kuat pikeun sinyal Wnt/-catenin sareng kamungkinan tanggung jawab pikeun kamekaran sél TNBC anu dimediasi miR-3662. Anyar-anyar ieu, Yi et al. mendakan yén sumbu miR-3662-HBP1 ngatur jalur sinyal Wnt/-catenin dina sél TNBC (Yi et al., 2022). Kusabab éksprési spésifik tumorna, miR-3662 tiasa janten target terapi poténsial pikeun TNBC. Ku kituna, knockdown miR-3662 anu dimediasi CRISPR/Cas9 tiasa janten pendekatan anu saé pikeun ngembangkeun ubar énggal pikeun pengobatan TNBC.
UBR5 nyaéta nukleophosphoprotein 300 kDa anu parantos diidentifikasi salaku régulator konci tumorigenesis, metastasis, sareng réspon imun dina rupa-rupa kanker (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 parantos dilaporkeun ningkat pisan dina sampel TNBC sareng ngarangsang fungsi ERα ku cara ngainduksi proliferasi ngalangkungan aktivitas ligase ubiquitin na (Bolt et al., 2015). Panilitian sekuensing exome sakabéh sampel TNBC primér ogé nunjukkeun paningkatan éksprési UBR5, nunjukkeun peranna dina pamekaran TNBC. Salaku tambahan, panghapusan UBR5 anu didorong ku CRISPR/Cas9 nunjukkeun inhibisi anu signifikan tina metastasis TNBC sareng kamekaran dina modél beurit ékspériméntal. Leuwih ti éta, kaasupna UBR5 dina modél beurit tipe liar mulangkeun fungsi pinuhna, sedengkeun pangaruh ieu henteu dititénan dina galur mutan anu teu diaktipkeun (Liao et al., 2017). Kurangna UBR5 aya patalina jeung ningkatna apoptosis, nekrosis, jeung inhibisi kamekaran tumor dina TNBC alatan angiogenesis anu goréng. Kusabab leungitna UBR5, panyebaran tumor ka organ anu jauh ngurangan, jeung UBR5 ngainduksi EMT abnormal utamana ku cara ngurangan éksprési E-cadherin (Zhang jeung Weinberg, 2018). Anyar-anyar ieu, UBR5 ditémbongkeun jadi faktor anu penting pisan dina transkripsi PDL1 anu diinduksi IFN-γ dina TNBC alatan kurangna aktivitas ubiquitinasi E3. Analisis transkriptom RNA ngungkabkeun yén UBR5 bisa jadi boga pangaruh sistemik kana gén anu aya patalina jeung jalur IFN-γ jeung ngamajukeun transaktivasi PDL1 ku cara ningkatkeun tingkat aktivasi protéin kinase RNA (PKR) jeung transduser jeung aktivator sinyalna. transkripsi 1 (STAT1) jeung faktor pangaturan interferon 1 (IRF1). Nanging, ablasi gabungan éksprési UBR5 sareng PD-L1 anu dimediasi ku CRISPR/Cas9 gaduh pangaruh terapi sinergis tibatan blokade nyalira, kalayan pangaruh anu ageung kana lingkungan mikro tumor (Wu et al., 2022). Ku kituna, CRISPR/Cas9 tiasa janten alat anu penting pikeun ngahambat fungsi UBR5, sahingga ngirangan metastasis TNBC sareng kamekaran tumor.
ROR1 nyaéta protéin transmembran tipe I anu diekspresikeun nalika kanker sareng kamekaran émbrionik sareng parantos diidéntifikasi salaku protéin onkofetal (Nicholas Borcherding, 2014). Paripolah invasif tina rupa-rupa kanker manusa aya hubunganana sareng paningkatan ROR1. Hasil anu ngajangjikeun parantos diala tina panilitian in vivo sareng in vitro anu ngalibatkeun sanyawa terapi anu nargétkeun ROR1 (Chien et al., 2016). Kadar mRNA ROR1 anu ningkat dina biopsi jaringan payudara ogé parantos aya hubunganana sareng tumor payudara sapertos basal (BL) anu agrésif sareng migrasina ka bagian awak anu sanés. Leuwih ti éta, overekspresi ROR1 parantos diidéntifikasi salaku pananda prognostik pikeun kamekaran TNBC (Chien et al., 2016). Nanging, ngareureuhkeun ROR1 nganggo CRISPR/Cas9 pikeun nyegah kamekaran sareng metastasis TNBC bakal janten strategi anu efektif.
Prosés sialilasi ngalibatkeun panambahan asam sialat kana glikokonjugat, anu dikatalisis ku sialyltransferases (ST). ST8SIA1 kagolong kana kulawarga ST sareng maénkeun peran penting dina patogenesis rupa-rupa panyakit sapertos leukemia limfositik sareng kanker kolorektal (Chang et al., 2018). Analisis runtuyan RNA nunjukkeun yén ST8SIA1 diekspresikan pisan dina jaringan payudara pasien TNBC sareng berkorelasi positif sareng mutasi dina gén supresor tumor p53, anu tiasa nyumbang kana patogenesis TNBC (Battula et al., 2017). Salaku tambahan, ST8SIA1 kalibet dina metastasis sareng kambuhna TNBC, nunjukkeun yén éta maénkeun peran penting dina kajadian sareng kamekaran TNBC. Dina modél in vitro TNBC, knockdown ST8SIA1 ku CRIPSR/Cas9 dipidangkeun pikeun meungpeuk kamekaran sareng metastasis (Battula et al., 2017). Ieu nunjukkeun yén CRISPR/Cas9 tiasa janten alat anu penting pikeun ngahambat fungsi onkogen ST8SIA1 dina pengobatan TNBC.
NAT1 nyaéta énzim métabolik anu ngatalisis formasi sanyawa xenobiotik fase II sareng diekspresikan dina ampir sadaya jaringan manusa. NAT1 tiasa nganggo kofaktor folat pikeun narékahan asetil-CoA (asetil-CoA) bahkan tanpa substrat amina aromatik (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Panilitian nunjukkeun yén NAT1 ngatur fungsi matriks metalloproteinase 9 (MMP9) dina modél sél kanker payudara sareng ngajaga tina spésiés oksigén réaktif (ROS) nalika kalaparan glukosa (Wang et al., 2018). Ngahapus NAT1 parantos dipidangkeun pikeun ngahambat kompleks piruvat dehidrogenase, anu ngarah kana disfungsi mitokondria (Wang L. et al., 2019). Salaku tambahan, rupa-rupa laporan sanés nunjukkeun yén inhibisi NAT1 nganggo molekul leutik sareng silencing siRNA tiasa ngirangan invasi sareng proliferasi sél kanker payudara (Stepp et al., 2018). Anyar-anyar ieu, CRISPR/Cas9 dianggo pikeun ngurangan NAT1 dina garis sél kanker payudara MDA-MB-231, anu mangaruhan métabolisme sél gumantung kana tingkat éksprési na. Panilitian ieu ogé nunjukkeun yén NAT-1 penting pisan pikeun kamajuan sareng metastasis TNBC (Carlisle et al., 2020).
Transkripsi onkogen anu dikoordinasikeun diatur ku super enhancer, faktor transkripsi, sareng kofaktor (Hnisz et al., 2015). Salian ti éta, sakelompok kinase anu gumantung kana siklin (CDK), sapertos CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, sareng CDK13, diperyogikeun pikeun pangaturan transkripsi. Di antarana, CDK7 kalibet dina fosforilasi RNA polimérase II, anu penting pisan pikeun inisiasi sareng ékspansi transkripsi onkogen dina patogenesis TNBC. Dina panilitian mani, ngahapus CDK7 ku CRISPR/Cas9 ngahambat TNBC, nunjukkeun yén patogenesis TNBC gumantung kana CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Panilitian nunjukkeun yén mutasi dina MYC sareng RBP (protein pangiket RNA) tiasa nyababkeun apoptosis, sedengkeun mutasi gén tunggal dina MYC atanapi RBP henteu mangaruhan kamekaran sél kanker (Einstein et al., 2021). Langkung ti 1000 RBP dina génom manusa parantos disaring nganggo perpustakaan berbasis CRISPR/Cas9. Di antarana, 57 RBP kapanggih penting pikeun kamekaran sél kanker kalayan tingkat MYC anu luhur pisan (Wheeler et al., 2020). Salaku tambahan, YTHDF2 penting pikeun ngajaga kamekaran sél TNBC sareng ngirangan jumlah transkrip termetilasi salami transkripsi sareng tarjamahan tingkat luhur dina sél kanker kalayan éksprési MYC anu langkung luhur. Salaku tambahan, YTHDF2 henteu penting pikeun sél kanker, anu kirang gumantung kana tingkat MYC anu luhur pikeun manjangkeun survival pasien TNBC (Einstein et al., 2021), nunjukkeun yén éta tiasa janten target terapi poténsial pikeun ubar anu tiasa ngungkulan TNBC.
Protéin ramo séng (ZNF) ngawangun sakitar 1% tina total génom manusa. Panilitian nunjukkeun yén ZNF tiasa ngatur proliferasi sél dina rupa-rupa kanker, sapertos kanker ati, kanker payudara sareng kanker kolorektal (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Perpustakaan anu dihasilkeun ku knockout CRISPR parantos dianggo pikeun nyaring rupa-rupa gén supresor tumor (TSG) dina sél kanker payudara (Shalem et al., 2014). Saprak harita, panilitian transkriptomik sél kanker payudara anu dihapus CRISPR/Cas9 ZNF319 parantos nunjukkeun yén ZNF319 mangrupikeun gén supresor tumor anu ngirangan proliferasi kanker payudara sareng ku kituna kalibet dina rupa-rupa mékanisme sinyal poténsial sareng fungsi biologis sanésna (Wang L. et al., 2022).
Ferroptosis nyaéta hiji jinis maotna sél anu diprogram anu gumantung kana ayana beusi. Dipikanyaho yén kamekaran ferroptosis dipangaruhan ku ayana peroksida lipid. Salian ti éta, PKCβII parantos dilaporkeun nunjukkeun peroksidasi lipid awal, sareng paningkatan peroksidasi lipid aya hubunganana sareng ferroptosis. Nyaring perpustakaan inhibitor kinase anu dimediasi CRISPR/Cas9 ngungkabkeun yén PKCβII kalibet dina prosés peroksidasi lipid, anu penting pikeun ferroptosis dina sél MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Ku alatan éta, ieu nunjukkeun yén knockout PKCβII ku CRISPR/Cas9 tiasa janten target gén supresor tumor poténsial pikeun pengobatan panyakit anu aya hubunganana sareng ferroptosis (Zhang et al., 2022).
Résistansi ubar diyakini tanggung jawab pikeun sakitar 90% maotna pasien kanker sareng mangrupikeun salah sahiji tantangan utama dina pangobatan kanker (Bukowski et al., 2020). Hasilna nunjukkeun yén jumlah gén anu cekap anu aya hubunganana sareng pangeluaran ubar, perbaikan DNA, apoptosis sareng rupa-rupa jalur sinyal sél aya hubunganana sareng résistansi ubar (Haider et al., 2020). Di antarana, sababaraha gén parantos ditarget ku alat CRISPR/Cas9 sareng parantos nunjukkeun hasil anu ngajangjikeun dina ngirangan résistansi ubar sareng ningkatkeun efektivitas pangobatan anti kanker (Vaghari-Tabari et al., 2022). Salaku tambahan, perpustakaan panyaringan knockout gén CRISPR/Cas9 throughput anu luhur parantos kalibet dina ngarobih fungsi target gén résistansi ubar poténsial (Shalem et al., 2015). Pikeun ngaidentipikasi gén résistansi paclitaxel, sekuensing RNA digabungkeun sareng panyaringan perpustakaan sgRNA sakumna génom dianggo pikeun ngaidentipikasi dalapan calon gén, kalebet histone deacetylase 9 (HDAC9), anu aya hubunganana sareng résistansi ubar dina pasien anu ngagaduhan TNBC anu kambuh (B et al., 2020). Dina panilitian anu sanés, paningkatan éksprési diserin/treonin sareng protéin kinase tirosin (DSTYK) dititénan salami salamet pasien TNBC anu diubaran ku ubar antikanker. Leuwih ti éta, knockdown DSTYK anu dimediasi CRISPR/Cas9 sacara signifikan ningkatkeun apoptosis sél kanker anu tahan ubar in vitro (sél SUM102PT sareng sél MDA-MB-468) sareng modél TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Sanaos TNBC ngagaduhan aktivasi jalur MAPK anu teu normal, pangaruh klinis tina terapi anu ditujukeun ka MEK goréng. Layar pustaka génomik CRISPR/Cas9 ngungkabkeun yén inhibisi PSMG2 (proteome assembly chaperone 2) ngajantenkeun sél TNBC BT549 sareng MB468 sénsitip kana inhibitor MEK AZD6244. Knockdown CRISPR/Cas9 tina PSMG2 ngarobih fungsi protéasom normal, anu ngarah kana pembongkaran PDPK1 anu dimediasi autophagy, sahingga langkung ningkatkeun sél tumor dina modél beurit TNBC anu diinduksi ku AZD6244 (MEK inhibitor) sareng MG132 (proteasom inhibitor). Ku kituna, inhibitor protéasom sareng MAP kinase (MEK) tiasa dikaluarkeun sacara sinergis pikeun ngirangan proliferasi sél tumor (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 ogé parantos dianggo pikeun nyaring leungitna fungsi gén anu nyababkeun résistansi TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al ngajelaskeun mékanisme résistansi ubar sél kanker anu diubaran ku JQ1, hiji inhibitor bromodomain BET (BBDI), dina TNBC. Ngagunakeun CRISPR/Cas9, aranjeunna mendakan yén ngahapus gén rb1 nyababkeun TNBC janten résistansi kana ubar anti kanker JQ1. Ku alatan éta, fungsi rb1 penting dina réspon kana ubar JQ1 dina TNBC. Aranjeunna ogé ngalaporkeun yén paclitaxel mangrupikeun inhibitor kinase/mikrotubulus CDK4/6, sareng kombinasina sareng BBDI sapertos JQ1 tiasa nyayogikeun réspon terapi anu ngajangjikeun pikeun TNBC anu résistansi ubar (Ge et al., 2020).
Bentang transkripsi RNA noncoding panjang (lncRNA) parantos dilaporkeun tanggung jawab kana résistansi kana terapi neoadjuvant dina TNBC. Panilitian ieu nunjukkeun yén lima transkrip lncRNA MALAT1 anu béda diekspresikan pisan dina TNBC. Salaku tambahan, delesi MALAT1 anu dimediasi CRISPR/Cas9 ningkatkeun sensitivitas sél TNBC BT-549 kana paclitaxel sareng doxorubicin, nunjukkeun peran poténsial pikeun résistansi MALAT1 dina TNBC (Shaath et al., 2021).
Mutasi dina BRCA1 (BRCA1m) téh hétérogén sahingga hésé dideteksi. Nargétkeun PARP1 (poli(ADP-ribose) polimérase), pasangan sintétis anu fatal tina BRCA1, tiasa ningkatkeun kemosensitivitas ubar TNBC. Ngagunakeun CRISPR/Cas9, ngahapus PARP1 ningkatkeun sensitivitas ubar antikanker sapertos doxorubicin, gemcitabine sareng docetaxel kana sél TNBC mutan mBRCA1, nunjukkeun yén PARP1 ogé kalibet dina résistansi ubar dina TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mutasi dina gén supresor tumor BRCA1 atanapi BRCA2 dipikanyaho ningkatkeun kamungkinan ngembangkeun kanker payudara dina jalma. Perawatan pasien ieu meryogikeun panggunaan inhibitor PARP. Salian ti éta, parantos dipidangkeun yén knockout tina faktor penyelamat nukléotida DNPH1 nganggo CRISPR/Cas9 tiasa miceun nukléotida 5-hidroksimetildeoksiuridin (hmdU) monofosfat toksik, sahingga ningkatkeun réspon sél anu kakurangan BRCA kana sensitivitas kana inhibitor PARP (Fugger). et al., 2021). Ku kituna, inhibitor CRISPR/Cas9 sareng PARP1 tiasa janten strategi pangobatan anu penting pikeun TNBC.
Gén glikoprotein penetran (P-gp) nyaéta gén résistansi multiobat anu umumna ningkat dina sakitar 41% tina sadaya TNBC (Sun et al., 2020). Éfluks ubar anu diinduksi P-gp parantos diidéntifikasi salaku régulator konci résistansi ubar dina kanker payudara. Inhibitor P-gp parantos nunjukkeun ningkatna sensitivitas kana ubar antikanker dina kanker payudara (Famta et al., 2021). Ku kituna, ablasi atanapi suprési inhibitor P-gp sareng P-gp anu dimediasi CRISPR/Cas9 tiasa janten metode anu penting pisan pikeun ngungkulan résistansi ubar dina TNBC.
Transporter kaset pangiket ATP G2 (ABCG2) dipikanyaho nyababkeun résistansi ubar dina TNBC (Palasuberniam et al., 2015), sanaos ayeuna teu aya laporan ngeunaan hubungan antara panyabutan CRISPR/Cas9 sareng ABCG2 sareng inaktivasi gén supresor tumor. PTEN Tiasa ningkatkeun aktivasi ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Ku alatan éta, ngagunakeun CRISP/Ca9 pikeun miceun ABCG2 sareng ngagabungkeunana sareng inhibitor ABCG2 tiasa janten perlakuan anu cocog pikeun ngungkulan résistansi ubar dina TNBC. Tabel 2 nyebatkeun CRISPR/Cas9 anu narékahan sadaya gén résistansi.
Tabel 2. CRISPR/Cas9 nargétkeun rupa-rupa gén résistansi TNBC pikeun ngasénsitipkeun sél kana ubar antikanker.
Pustaka CRISPR/Cas9 mangrupikeun alat anu poténsial pikeun nyaring mutasi gén anu aya hubunganana sareng patogenesis kanker (Chan et al., 2022). Métode panyaringan ieu ngalibatkeun opat léngkah sapertos (a) konstruksi pustaka, (b) transduksi lentiviral, (c) panyaringan fenotipik, sareng (d) analisis gén target. Sanaos TNBC ngagaduhan aktivasi jalur MAPK anu teu normal, prognosis klinis terapi target MEK pikeun pasien TNBC anu mawa mutasi dina gén supresor tumor sapertos PTEN, RB1, sareng TP53 goréng pisan.
Salian ti éta, saringan knockout gén nganggo CRISPR/Cas9 nguji molekul anu paling kuat sareng selektif, dehydrocatrol, anu seueur dina ekstrak kembang sareng daun Guatemala, pikeun ngartos pangaruh dehydrocatrol kana MDA-MB-231. Mékanisme sitotoksisitas sél selektif. Karakteristik stemness mesenchymal tina subtipe TNBC. Saringan dumasar CRISPR/Cas9 ieu ogé ngungkabkeun yén HSD17B11, gén anu ngodekeun 17β-hydroxysteroid dehydrogenase tipe 11, diekspresikan pisan dina sél MDA-MB-231 sareng ngahasilkeun dehydrofalcarinol khusus pikeun sél MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Ku kituna, ieu nunjukkeun yén saringan génomik CRISPR/Cas9 gaduh poténsi anu ageung dina ngaidentipikasi mékanisme anu aya dina sipat antikanker tina sanyawa alami poténsial.
Salian ti éta, karentanan TNBC kana kanker diulik ngagunakeun layar CRISPR/Cas9 in vivo anu teu bias sacara génom, anu nunjukkeun hubungan antara jalur onkogenik sareng supresor tumor. Komponén konci jalur mTOR sareng Hippo parantos dilaporkeun maénkeun peran penting dina régulasi tumor dina TNBC. Salian ti éta, panilitian nunjukkeun yén inhibisi farmakologis onkoprotein mTORC1/2 sareng YAP sacara efektif ngahambat patogenisitas TNBC ngagunakeun modél sinergi matriks ubar in vitro sareng xenograft anu diturunkeun ku pasien in vivo. Leuwih ti éta, inhibisi mTORC1/2 anu dimediasi Torin-1 ningkatkeun makropinositosis, sedengkeun inhibisi YAP anu diinduksi verteporfin nyababkeun maotna sél TNBC. Sacara gembleng, hasil ieu nyorot kakuatan sareng kateguhan panyaringan CRISPR in vivo sacara génom pikeun ngaidentipikasi pangobatan anyar sareng efektif pikeun TNBC (Dai et al., 2021).
Disregulasi sistem imun mangrupikeun faktor penting dina tumorigenesis. Sél kanker nyingkahan pambersihan imun ku cara ngalangkungan mékanisme pertahanan, kalebet ngaganggu aktivitas sél imun dina lingkungan mikro tumor sareng ngaruksak sistem imun. Ku alatan éta, ngembangkeun sistem imun anu ningkat tiasa janten pendekatan konci pikeun merangan tumor. Panggunaan modifikasi gén dumasar CRISPR/Cas9 ngabahas sababaraha masalah anu aya hubunganana sareng disfungsi imun tina sudut pandang anu béda. CRISPR/Cas9 parantos dianggo pikeun ningkatkeun imunitas antitumor ngalawan kanker payudara ngalangkungan jalur ieu (Gambar 3).
Gambar 3. Imunoterapi CRISPR/Cas9 narékahan sél TNBC. Leungitna CDK5 sareng knockdown PDL1 sareng CD155 ningkatkeun sistem imun. Kitu ogé, leungitna A2AR sareng knockdown TAA sapertos HER2, mucin 1 sareng TEM8 ningkatkeun efisiensi sél CAR-T dina maehan sél kanker. Skrining sél T anu didorong ku CRISPR/Cas9 parantos nunjukkeun yén gangguan p38 kinase ningkatkeun aktivitas antitumor sél T. Sél T anu dirobih ku CRISPR/Cas9 ningkatkeun éksprési TCR (reséptor sél T), anu ngahasilkeun sél T anu gaduh aktivitas antitumor.
Tujuan imunoterapi nyaéta pikeun ngarangsang sistem imun pikeun nyerang sél kanker. Éksprési protéin titik pamariksaan imun anu kaleuleuwihi biasana nyegah réaksi otoimun tapi tiasa ngabantosan kanker nyingkahanana (Topalian et al., 2015). Protéin ieu nyegah réaksi imun ku cara ngabeungkeut kana reséptor dina permukaan sél imun. Sababaraha protéin titik pamariksaan (sapertos CD155 sareng PD-L1) narékahan reséptor PD-1 dina sél imun sareng diekspresikeun dina kanker payudara, khususna TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Knockdown PD-L1 atanapi reséptorna nganggo CRISPR/Cas9 tiasa ngarangsang sistem imun pikeun nyerang tumor TNBC (Yahata et al., 2019). Salaku tambahan, downregulation éksprési PD-L1 ngaliwatan ngahapus CDK5 anu dimediasi CRISPR/Cas9 parantos dipidangkeun pikeun ngahambat kamekaran tumor in vitro sareng in vivo (Deng et al., 2020). Inhibisi pertumbuhan dina modél kanker payudara in vitro sareng in vivo nunjukkeun yén réduksi CD155 anu dimediasi shRNA tiasa gaduh pangaruh terapi kana kanker payudara (Gao et al., 2018).
Sél T CAR ngébréhkeun CAR anu mikawanoh antigén anu aya hubunganana sareng tumor (TAA) sareng tiasa nganggo knockdown protéin checkpoint pikeun ningkatkeun aktivitasna (Li C. et al., 2020). Aya sababaraha target poténsial pikeun terapi sél T CAR dina kanker payudara, kalebet sababaraha TAA sapertos HER2, mucin1, sareng TEM8 (Bajgain et al., 2018). Aya bukti yén sél T CAR anu nargétkeun mesothelin (overexpressed dina sél TNBC BT-459) langkung efektif ngalawan kanker nalika PD-1 di-knockout nganggo CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Nanging, ngasingkeun sél T tina pasien teras ngéditna ex vivo mangrupikeun prosés anu intensif tanaga sareng nyéépkeun waktos. Sanaos sél T universal tiasa ngirangan sarat isolasi, sél T donor anu ngébréhkeun antigén leukosit manusa (HLA) kelas I sareng reséptor sél T (TCR) kedah dipiceun pikeun nyegah abnormalitas graft-versus-host (Ren et al., 2017). , 2017a). Ngagunakeun CRISPR/Cas9, HDR tiasa sacara simultan ngaleungitkeun TCR sareng HLA sareng ngaleungitkeun gén anu ngodekeun CAR. Panilitian nunjukkeun yén CRISPR/Cas9 tiasa dianggo pikeun ngenalkeun CAR anti-CD19 kana lokus TCR, sahingga ngahasilkeun CAR sacara efisien tanpa ngirangan sél T (Dimitri et al., 2022). Téhnologi multipleks parantos dikembangkeun pikeun ngahasilkeun sél T CAR alogenik ku cara sacara simultan ngaleungitkeun TCR, beta-2-mikroglobulin (B2M), subunit HLA-I sareng protéin sanés sapertos PD-1 sareng CTLA-4, anu tiasa gaduh sipat anti kanker anu langkung ageung. ngalawan TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Ngagunakeun CRISPR/Cas9 tiasa ningkatkeun efektivitas sél CAR-T. Adénosin dipikanyaho gaduh sipat imunosupresif sareng tiasa ngirangan imunitas antikanker ku cara ngahalangan fungsi sél T sareng ngaktipkeun reséptor adénosin A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Ngareureuhkeun A2AR nganggo CRISPR/Cas9 sacara signifikan ningkatkeun efektivitas sél CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). Sél T dipikanyaho nunjukkeun rupa-rupa ciri fenotipik sapertos ékspansi sél, diferensiasi, setrés oksidatif sareng setrés génomik. Skrining sél T dumasar CRISPR/Cas9 ngungkabkeun gangguan 25 reséptor kinase sél T anu béda. Di antarana, ngahapus p38 kinase parantos dipidangkeun pikeun ningkatkeun aktivitas antitumor sél T, nunjukkeun yén p38 kinase mangrupikeun régulator konci pangaturan sél CAR-T (Gurasamy et al., 2020).
Sél T bisa dirobah sacara genetik maké CRISPR/Cas9 pikeun ngahasilkeun TCR anu diekspresikeun kalawan luhur. Mindahkeun sél T anu dirobah sacara genetik ka pasien geus némbongkeun aktivitas antikanker anu leuwih kuat tibatan sél T éndogén. Ku kituna, TCR éndogén bisa bersaing jeung TCR anu dirobah sacara genetik dina pasien, anu bisa mangaruhan poténsi imunoterapi kanker. Pikeun ngungkulan masalah ieu, maké CRISPR/Cas9 pikeun miceun TCR-β éndogén dina sél panampi sarta salajengna mindahkeun sél T TCR-β ka pasien kanker bisa némbongkeun réspon imun antikanker anu leuwih hadé tanpa kudu kompetisi séksual TCR éndogén (Fan et al. 2018). Ku kituna, iwal sél T anu dirobah CRISPR, TCR sarébu kali leuwih sénsitip kana antigén tumor tibatan sél T anu ditransduksi TCR normal. Salian ti éta, dina rupa-rupa leukemia, sél T anu dirobah anu dihasilkeun ku γδ TCR+ CRISPR némbongkeun éksprési sél T CD4+ jeung CD8+ anu leuwih luhur tibatan transfer TCR standar (Legut et al., 2018). Ku kituna, sél T anu dimodifikasi anu dihasilkeun ku CRISPR/Cas9 tiasa janten metode imunoterapi anu efektif pikeun ngungkulan TNBC.
Integrin nyaéta molekul adhesi sél anu aya dina transmembran sél sareng ngamajukeun beungkeutan sél kana matriks ékstrasélulér (ECM) (Hamidi sareng Ivaska, 2018). Disregulasi integrin aya hubunganana sareng kamekaran sareng migrasi kanker ku cara ngarobih matriks ékstrasélulér, anu ngarah kana salametna sél kanker dina sirkulasi (Hamidi sareng Ivaska, 2018). Knockdown integrin anu dimediasi CRISPR/Cas9 ngalambatkeun kamajuan tumor, metastasis, sareng kolonisasi dina TNBC. Knockdown integrin a5 (ITGA5) parantos dilaporkeun ngirangan migrasi sareng kamajuan sél dina kanker sanés sapertos kanker paru-paru (Ju et al., 2017), nunjukkeun yén integrin a5 ogé tiasa janten faktor konci dina patogenesis TNBC.
Ngahasilkeun beurit knockout nganggo metode sél stém émbrionik (ES) tradisional mangrupikeun prosés anu intensif tanaga, nyéépkeun waktos, sareng teu efisien. Butuh sababaraha bulan sareng taun pikeun narékahan sél ES ngalangkungan rekombinasi homolog, beternak beurit kimérik, teras nyilangkeunana sareng beurit hétérozigot pikeun ngahasilkeun turunan homozigot. Perkawinan silang anu rumit diperyogikeun pikeun nyiptakeun beurit kalayan sababaraha mutasi genetik. Nanging, seueur masalah anu timbul nalika nganggo beurit anu dihasilkeun ku ablasi sél ES nganggo CRISPR/Cas9 atanapi ku cara nyuntik komponén CRISPR/Cas9 kana endog anu dibuahan sél tunggal. Salaku conto, bubuka parobahan sering kajantenan dina lokus biallelik sareng henteu spésifik gén. Nembe dilaporkeun yén sél ES anu nganggo téknologi CRISPR/Cas9 tiasa sacara simultan nyelapkeun mutasi biallelik dina dugi ka 5 gén (Nishizono et al., 2021). Pikeun tujuan ieu, mRNA Cas9 sareng lima gRNA spésifik gén sacara simultan ditransfeksi kana sél ES. Ieu nyorot jangji sareng efektivitas prosedur ieu, sanaos mutasi ieu panginten parantos diwariskeun nalika garis pendiri dikembangbiakan pikeun ngahasilkeun beurit knockout quintuple. Panilitian ieu ogé ngalaporkeun panemuan anu ngajentul: sél ES henteu diperyogikeun deui pikeun nyiptakeun beurit anu dirobih sacara genetik. Sabalikna, pikeun miceun produk gén khusus, mRNA Cas9 sareng gRNA disuntikkeun kana émbrio tahap sél tunggal. Hasilna, garis pendiri knockout parantos didamel anu sacara téoritis tiasa dianggo pikeun nalungtik akibat tina ngahapus gén dina beurit (Qin et al., 2016). Ku kituna, CRISPR/Cas9 ngamungkinkeun nyiptakeun beurit transgenik pikeun ngubaran TNBC kalayan biaya anu langkung handap tibatan rékayasa genetik tradisional. Ngagunakeun sistem CRISPR/Cas, modél beurit knockout énggal parantos dikembangkeun anu tiasa suksés ngenalkeun mutasi titik dina hiji atanapi langkung gén éndogén dina TNBC. Dumasar kana konsép ieu, modél sato TNBC ogé tiasa dikembangkeun nganggo panghapusan BRCA1 sareng p53 anu dimediasi ku CRISPR/Cas9, anu nyababkeun leungitna perbaikan HR, ketidakstabilan genomik, sareng fenotipe mutan (Annunziato et al., 2020).
Ayeuna, rupa-rupa metode sapertos mamografi, pencitraan résonansi magnét (MRI) sareng ultrasound dianggo pikeun diagnosa TNBC. Nanging, metode ieu ngagaduhan sababaraha watesan. Mamografi dianggo pikeun diagnosa jaringan payudara lokal tinimbang metastasis, dimana sél kanker parantos hijrah ka organ sanés. Ultrasonografi sanés metode anu tiasa dipercaya pikeun diagnosa TNBC (Chen sareng Lee-Felker, 2023). MRI ngagaduhan sensitivitas anu langkung luhur tibatan ultrasound sareng mamografi, tapi akurasi diagnostikna terbatas (Sha sareng Chen, 2022). Biopsi jaringan mangrupikeun cara invasif pikeun ngaidentipikasi sél kanker. Nanging, dina sababaraha kasus, biopsi tiasa sono kana jaringan kanker upami jarumna nyimpang tina daérah anu dipikaresep. Salaku tambahan, éta mahal pisan sareng tiasa traumatis pikeun pasien. TNBC mangrupikeun jinis kanker anu hétérogén, janten biopsi tiasa henteu nyayogikeun inpormasi anu cekap ngeunaan jinis kanker. Ku alatan éta, metode diagnostik anu dipercaya sacara énggal pikeun ngadeteksi TNBC diperyogikeun pisan. CRISPR/Cas9 tiasa janten alternatif anu sénsitip pisan sareng minimal invasif pikeun diagnosis kanker payudara. Pikeun tujuan ieu, strategi dumasar CRISPR/Cas9 tiasa dianggo pikeun ningkatkeun metode PCR pikeun diagnosis TNBC. Mimitina, protéin Cas9 sareng cpf1 tina sistem CRISPR dianggo pikeun miceun DNA non-spésifik, teras dua protéin ieu (Cas9 sareng cpf1) tiasa mikawanoh runtuyan PAM sateuacan ngabeungkeut kana DNA target (Deepak Singh et al., 2021). Ku kituna, PCR tiasa ngaidentipikasi mutasi anu aya hubunganana sareng kamekaran kanker. Sababaraha panilitian parantos ngadopsi strategi dumasar CRISPR ieu pikeun ngadeteksi mutasi anu béda dina kanker anu béda (Safari et al., 2019). Ku kituna, metode PCR dumasar CRISPR tiasa ngirangan gumantungna diagnosis TNBC kana metode invasif sapertos imunohistokimia dumasar biopsi.
Parobihan génotipik dina pangaturan reséptor hormon ogé parantos dipidangkeun dina TNBC (Chen sareng Russo, 2009). Strategi PCR berbasis CRISPR/Cas9 anu nganggo microarray pikeun diagnostik di tempat perawatan tiasa sacara efektif ngawas mutasi ieu (Hajian et al., 2019). Éta ogé tiasa nyayogikeun inpormasi anu relevan ngeunaan mutasi khusus dina pasien TNBC ka panyadia kasehatan, anu tiasa ngabantosan ningkatkeun jalan perawatanana. Nanging, téknik gabungan ieu ngagaduhan watesan. Ku alatan éta, upaya panalungtikan anu éksténsif diperyogikeun sateuacan metode CRISPR/Cas-PCR ieu tiasa dianggo dina kasehatan pikeun diagnosis TNBC (Yang et al., 2019).