Diagnosis diferensial tina nodul pulmonal anu diidentipikasi ku tomografi komputasi (CT) tetep tangtangan dina prakték klinis.Di dieu, urang ciri métabolisme global 480 sampel sérum, kaasup kadali cageur, nodules lung benign, sarta tahap I lung adenocarcinoma.Adenocarcinomas nunjukkeun propil métabolik anu unik, sedengkeun nodul benign sareng individu séhat gaduh kasaruaan anu luhur dina profil métabolik.Dina grup pamanggihan (n = 306), sakumpulan 27 métabolit diidentifikasi pikeun ngabédakeun nodul benign sareng ganas.AUC tina model diskriminan dina validasi internal (n = 104) jeung validasi éksternal (n = 111) grup éta 0.915 jeung 0.945, mungguh.Analisis jalur ngungkabkeun paningkatan métabolit glikolitik anu aya hubunganana sareng turunna triptofan dina sérum adenokarsinoma paru-paru dibandingkeun sareng nodul benign sareng kontrol séhat, sareng nyarankeun yén nyerep triptofan ngadorong glikolisis dina sél kanker paru-paru.Ulikan kami nyorot nilai biomarker métabolit sérum dina ngira-ngira résiko nodul pulmonal anu dideteksi ku CT.
Diagnosis awal penting pikeun ningkatkeun tingkat kasalametan pasien kanker.Hasil tina Uji Saringan Kanker Paru Nasional AS (NLST) sareng Studi NELSON Éropa nunjukkeun yén saringan sareng tomografi diitung dosis rendah (LDCT) tiasa sacara signifikan ngirangan mortalitas kanker paru-paru dina kelompok résiko luhur1,2,3.Kusabab pamakéan nyebar tina LDCT pikeun screening kanker paru, nu incidence papanggihan radiographic incidental of nodules pulmonal asimtomatik geus terus ningkat 4.Nodul pulmonal dihartikeun salaku opacity fokus nepi ka 3 cm diaméterna 5 .Urang nyanghareupan kasusah dina assessing likelihood malignancy jeung kaayaan jumlah badag nodules pulmonal kauninga saliwatan on LDCT.Watesan CT bisa ngakibatkeun sering pamariksaan nurutan-up jeung hasil palsu-positip, ngarah kana campur teu perlu jeung overtreatment6.Ku alatan éta, aya kabutuhan pikeun ngembangkeun biomarkers dipercaya jeung mangpaat pikeun bener ngaidentipikasi kanker paru dina tahap awal jeung ngabedakeun nodules paling benign dina deteksi awal 7 .
Analisis molekular komprehensif getih (sérum, plasma, sél mononuklear getih periferal), kaasup génomics, proteomics atawa DNA methylation8,9,10, geus ngarah ka tumuwuh minat dina kapanggihna biomarkers diagnostik pikeun kanker paru.Samentara éta, pendekatan métabolomik ngukur produk tungtung sélular anu dipangaruhan ku tindakan endogen sareng eksogen sahingga diterapkeun pikeun ngaduga awal panyakit sareng hasilna.Cairan kromatografi-tandem spéktrométri massa (LC-MS) mangrupakeun metoda loba dipaké pikeun studi metabolomics alatan sensitipitas tinggi na rentang dinamis badag, nu bisa nutupan métabolit jeung sipat physicochemicals béda11,12,13.Sanajan analisis métabolik global plasma / sérum geus dipaké pikeun ngaidentipikasi biomarkers pakait sareng diagnosis kanker paru14,15,16,17 jeung efficacy perlakuan, 18 classifiers métabolit sérum keur ngabedakeun antara benign na malignant lung nodules tetep jadi loba diajar.- panalungtikan masif.
Adenocarcinoma sareng karsinoma sél skuamosa mangrupikeun dua subtipe utama kanker paru sél non-leutik (NSCLC).Rupa-rupa tés saringan CT nunjukkeun yén adenocarcinoma mangrupikeun jinis histologis kanker paru anu paling umum1,19,20,21.Dina ulikan ieu, urang ngagunakeun ultra-kinerja cair kromatografi-resolusi luhur spéktrométri massa (UPLC-HRMS) pikeun ngalakukeun analisis metabolomics on total 695 sampel sérum, kaasup kadali cageur, nodules pulmonal benign, sarta CT-dideteksi ≤3 cm.Screening pikeun adenocarcinoma paru Tahap I.Kami ngaidentipikasi panel métabolit sérum anu ngabédakeun adenokarsinoma paru tina nodul benign sareng kontrol séhat.Analisis pengayaan jalur ngungkabkeun yén métabolisme triptofan sareng glukosa anu abnormal mangrupikeun parobahan umum dina adenocarcinoma paru dibandingkeun sareng nodul benign sareng kontrol séhat.Tungtungna, urang ngadegkeun tur disahkeun a classifier métabolik sérum kalawan spésifisitas tinggi na sensitipitas keur ngabedakeun antara nodules pulmonal malignant na benign kauninga ku LDCT, nu bisa rojong dina diagnosis diferensial mimiti na assessment résiko.
Dina ulikan ayeuna, sampel sérum kelamin jeung umur-cocog sacara retrospectively dikumpulkeun ti 174 kadali cageur, 292 penderita nodules pulmonal benign, sarta 229 penderita adenocarcinoma paru tahap I.Karakteristik demografi tina 695 mata pelajaran dipidangkeun dina Tabel Tambahan 1.
Ditémbongkeun saperti dina Gambar 1a, jumlahna aya 480 sampel sérum, kaasup 174 kontrol cageur (HC), 170 benign nodules (BN), jeung 136 tahap I lung adenocarcinoma (LA) sampel, dikumpulkeun di Sun Yat-sen Universitas Kangker Center.Papanggihan kohort pikeun profil métabolomik anu teu disasarkeun ngagunakeun ultra-kinerja cair kromatografi-resolusi luhur spéktrométri massa (UPLC-HRMS).Sapertos anu dipidangkeun dina Gambar Tambahan 1, métabolit diferensial antara LA sareng HC, LA sareng BN diidentifikasi pikeun ngadamel modél klasifikasi sareng ngajalajah analisis jalur diferensial.104 sampel dikumpulkeun ku Sun Yat-sen Universitas Kanker Center sarta 111 sampel dikumpulkeun ku dua rumah sakit séjén anu subjected kana validasi internal tur éksternal, masing-masing.
a Populasi ulikan dina kohort kapanggihna nu underwent analisis sérum métabolomics global ngagunakeun ultra-kinerja cair kromatografi-resolusi luhur spéktrométri massa (UPLC-HRMS).b Analisis diskriminan parsial sahenteuna kuadrat (PLS-DA) tina total métabolisme 480 sampel sérum tina kohort ulikan, kalebet kadali séhat (HC, n = 174), nodul benign (BN, n = 170), sareng adenokarsinoma paru-paru tahap I. (Los Angeles, n = 136).+ ESI, mode ionisasi electrospray positif, -ESI, mode ionisasi electrospray négatip.c–e Métabolit kalayan kalimpahan anu béda sacara signifikan dina dua kelompok anu dipasihkeun (uji pangkat ditandatanganan Wilcoxon dua buntut, nilai p disaluyukeun tingkat penemuan palsu, FDR <0.05) dipidangkeun dina warna beureum (robah melu > 1.2) jeung biru (robah melu <0.83) .) ditémbongkeun dina grafik gunung seuneuan.f Peta panas clustering hirarki némbongkeun béda anu signifikan dina jumlah métabolit annotated antara LA na BN.Data sumber disayogikeun dina wangun file data sumber.
Total métabolisme sérum tina 174 HC, 170 BN jeung 136 LA dina grup kapanggihna dianalisis ngagunakeun analisis UPLC-HRMS.Urang mimiti nunjukkeun yén sampel kontrol kualitas (QC) klaster pageuh di puseur model analisis komponén poko (PCA) unsupervised, confirming stabilitas kinerja ulikan ayeuna urang (Suplemén Gambar 2).
Ditémbongkeun saperti dina analisis parsial sahenteuna kuadrat-diskriminasi (PLS-DA) dina Gambar 1 b, urang manggihan yén aya béda jelas antara LA jeung BN, LA jeung HC dina positip (+ ESI) jeung négatip (-ESI) modus ionisasi electrospray. .terasing.Tapi, henteu aya béda anu signifikan anu kapanggih antara BN sareng HC dina kaayaan +ESI sareng -ESI.
Kami mendakan 382 fitur diferensial antara LA sareng HC, 231 fitur diferensial antara LA sareng BN, sareng 95 fitur diferensial antara BN sareng HC (test rank ditandatanganan Wilcoxon, FDR <0,05 sareng sababaraha parobahan> 1,2 atanapi <0,83) (Gambar .1c-e )..Puncak anu salajengna annotated (Supplementary Data 3) ngalawan database (mzCloud / HMDB / Chemspider perpustakaan) ku nilai m / z, waktos ingetan jeung fragméntasi pilarian spéktrum massa (detail dijelaskeun dina bagian Métode) 22.Tungtungna, 33 sareng 38 annotated métabolit kalayan béda anu signifikan dina kaayaanana diidentifikasi pikeun LA versus BN (Gambar 1f sareng Suplemén Tabel 2) sareng LA versus HC (Suplemén Gambar 3 sareng Suplemén Tabel 2), masing-masing.Kontras, ngan ukur 3 métabolit kalayan bédana anu signifikan dina kaayaanana diidentifikasi dina BN sareng HC (Tabel Tambahan 2), konsisten sareng tumpang tindihna antara BN sareng HC dina PLS-DA.Métabolit diferensial ieu nutupan rupa-rupa biokimia (Gambar Tambahan 4).Dihijikeun, hasil ieu nunjukkeun parobahan anu signifikan dina métabolisme sérum anu ngagambarkeun transformasi ganas kanker paru-paru tahap awal dibandingkeun sareng nodul paru-paru benign atanapi subjék séhat.Samentara éta, kasaruaan métabolisme sérum BN sareng HC nunjukkeun yén nodul pulmonal benign tiasa ngabagi seueur ciri biologis sareng jalma anu séhat.Nunjukkeun yén mutasi gen reséptor faktor pertumbuhan épidermal (EGFR) umum dina subtipe adenocarcinoma paru-paru 23, urang narékahan pikeun nangtukeun dampak mutasi supir dina métabolisme sérum.Urang teras nganalisis profil métabolik sakabéh 72 kasus kalayan status EGFR dina grup adenocarcinoma paru.Narikna, kami mendakan profil anu dibandingkeun antara pasien mutant EGFR (n = 41) sareng pasien tipe liar EGFR (n = 31) dina analisis PCA (Suplemén Gambar 5a).Najan kitu, urang ngaidentipikasi 7 métabolit anu kaayaanana ieu sacara signifikan dirobah dina penderita mutasi EGFR dibandingkeun penderita tipe liar EGFR (test t, p <0.05 sarta robah melu> 1.2 atawa <0.83) (Suplemén Gambar 5b).Mayoritas métabolit ieu (5 ti 7) mangrupakeun acylcarnitines, nu maénkeun peran penting dina jalur oksidasi asam lemak.
Salaku digambarkeun dina workflow ditémbongkeun dina Gambar 2 a, biomarkers pikeun klasifikasi nodule dicandak ngagunakeun operator shrinkage mutlak pangsaeutikna sarta Pilihan dumasar kana 33 métabolit diferensial dicirikeun dina LA (n = 136) jeung BN (n = 170).Kombinasi pangalusna variabel (LASSO) - modél régrési logistik binér.Validasi silang sapuluh lipet digunakeun pikeun nguji réliabilitas modél.Pilihan variabel sareng regularisasi parameter disaluyukeun ku pinalti maksimalisasi kamungkinan sareng parameter λ24.Analisis metabolomics global satuluyna dipigawé sacara mandiri dina validasi internal (n = 104) jeung validasi éksternal (n = 111) grup pikeun nguji kinerja klasifikasi model diskriminan.Hasilna, 27 métabolit dina set kapanggihna diidentifikasi minangka model diskriminan pangalusna jeung nilai AUC rata pangbadagna (Gbr. 2b), diantara nu 9 geus ngaronjat aktivitas jeung 18 turun aktivitas di LA dibandingkeun BN (Gbr. 2c).
Workflow pikeun ngawangun classifier nodule pulmonal, kaasup milih panel pangalusna métabolit sérum dina set kapanggihna ngagunakeun modél régrési logistik binér via sapuluh-melu cross-validasi sarta evaluating kinerja prediksi dina set validasi internal tur éksternal.b Statistik cross-validasi modél régrési LASSO pikeun pamilihan biomarker métabolik.Angka-angka di luhur ngagambarkeun jumlah rata-rata biomarker anu dipilih dina λ anu ditangtukeun.Garis dotted beureum ngagambarkeun nilai AUC rata dina lambda pakait.Bar kasalahan abu ngagambarkeun nilai AUC minimum sareng maksimum.Garis dotted nunjukkeun model pangalusna kalawan 27 biomarkers dipilih.AUC, wewengkon handapeun kurva karakteristik operasi panarima (ROC).c Lipat parobahan 27 métabolit dipilih dina grup LA dibandingkeun jeung grup BN dina grup kapanggihna.Kolom beureum - aktivasina.Kolom biru mangrupikeun turunna.Kurva karakteristik operasi panarima (ROC) d–f nunjukkeun kakuatan modél diskriminan dumasar kana 27 kombinasi métabolit dina set validasi panemuan, internal sareng éksternal.Data sumber disayogikeun dina wangun file data sumber.
Model prediksi didamel dumasar kana koefisien régrési beurat tina 27 métabolit ieu (Tabel Tambahan 3).Analisis ROC dumasar kana ieu 27 métabolit yielded aréa handapeun kurva (AUC) nilai 0,933, sensitipitas group kapanggihna 0,868, sarta spésifisitas 0,859 (Gbr. 2d).Samentara éta, diantara 38 métabolit diferensial annotated antara LA sareng HC, sakumpulan 16 métabolit ngahontal AUC 0.902 kalayan sensitipitas 0.801 sareng spésifisitas 0.856 dina ngabédakeun LA tina HC (Suplemén Gambar 6a-c).Nilai AUC dumasar kana ambang parobahan lipatan anu béda pikeun métabolit diferensial ogé dibandingkeun.Kami mendakan yén modél klasifikasi ngalaksanakeun pangsaéna dina ngabédakeun antara LA sareng BN (HC) nalika tingkat parobahan lipatan disetel ka 1.2 versus 1.5 atanapi 2.0 (Suplemén Gambar 7a, b).Modél klasifikasi, dumasar kana 27 gugus métabolit, satuluyna disahkeun dina cohorts internal sareng eksternal.AUC éta 0,915 (sensitipitas 0,867, spésifisitas 0,811) pikeun validasi internal tur 0,945 (sensitipitas 0,810, spésifisitas 0,979) pikeun validasi éksternal (Gbr. 2e, f).Pikeun meunteun efisiensi interlaboratorium, 40 conto tina cohort éksternal dianalisis dina laboratorium éksternal sakumaha anu dijelaskeun dina bagian Métode.Katepatan klasifikasi ngahontal AUC 0.925 (Suplemén Gambar 8).Kusabab lung squamous cell carcinoma (LUSC) mangrupikeun subtipe paling umum kadua pikeun kanker paru sél non-leutik (NSCLC) saatos adenocarcinoma paru (LUAD), kami ogé nguji utilitas poténsial anu disahkeun tina profil métabolik.BN sareng 16 kasus LUSC.AUC diskriminasi antara LUSC sareng BN nyaéta 0.776 (Suplemén Gambar 9), nunjukkeun kamampuan anu langkung goréng dibandingkeun diskriminasi antara LUAD sareng BN.
Studi geus ditémbongkeun yén ukuran nodules on gambar CT ieu positif correlated kalawan likelihood malignancy sarta tetep determinant utama nodule treatment25,26,27.Analisis data tina cohort badag tina ulikan screening NELSON némbongkeun yén résiko malignancy dina subjék kalawan titik <5 mm éta malah sarupa dina subjék tanpa titik 28.Ku alatan éta, ukuran minimum merlukeun ngawas CT biasa 5 mm, sakumaha dianjurkeun ku British Thoracic Society (BTS), sarta 6 mm, sakumaha dianjurkeun ku Fleischner Society 29.Sanajan kitu, nodules leuwih badag batan 6 mm sarta tanpa fitur benign atra, disebut nodules pulmonal indeterminate (IPN), tetep tangtangan utama dina evaluasi sarta manajemén dina praktekna klinis30,31.Urang salajengna nalungtik naha ukuran nodule dipangaruhan tanda tangan métabolik ngagunakeun sampel pooled tina kapanggihna jeung cohorts validasi internal.Fokus kana 27 biomarker anu disahkeun, urang mimiti ngabandingkeun profil PCA of HC sareng BN sub-6 mm metabolom.Kami mendakan yén kalolobaan titik data pikeun HC sareng BN tumpang tindih, nunjukkeun yén tingkat métabolit sérum sami dina duanana grup (Gbr. 3a).Peta fitur sakuliah rentang ukuran béda tetep conserved di BN jeung LA (Gbr. 3b, c), sedengkeun separation ieu observasi antara nodules malignant na benign dina rentang 6-20 mm (Gbr. 3d).Cohort ieu ngagaduhan AUC 0.927, spésifisitas 0.868, sareng sensitipitas 0.820 pikeun ngaduga malignancy nodul ukuran 6 dugi ka 20 mm (Gbr. 3e, f).Hasil kami nunjukkeun yén classifier tiasa nangkep parobahan métabolik anu disababkeun ku transformasi malignant awal, henteu paduli ukuran nodul.
ad Babandingan propil PCA antara grup dieusian dumasar kana classifier métabolik 27 métabolit.CC jeung BN <6 mm.b BN <6 mm vs BN 6–20 mm.dina LA 6-20 mm versus LA 20-30 mm.g BN 6-20 mm sarta LA 6-20 mm.GC, n = 174;BN <6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20-30 mm, n = 77. e Receiver operasi ciri (ROC) kurva némbongkeun kinerja model diskriminan pikeun nodules 6-20 mm.f Nilai probabilitas diitung dumasar kana modél régrési logistik pikeun nodul ukuran 6–20 mm.Garis dotted abu ngagambarkeun nilai cutoff optimal (0.455).Angka-angka di luhur ngagambarkeun persentase kasus anu diarepkeun pikeun Los Angeles.Ngagunakeun uji t Student dua-buntut.PCA, analisis komponén poko.aréa AUC handapeun kurva.Data sumber disayogikeun dina wangun file data sumber.
Opat sampel (yuswa 44-61 taun) kalawan ukuran nodule pulmonal sarupa (7-9 mm) salajengna dipilih pikeun ngagambarkeun kinerja model prediksi malignancy diusulkeun (Gbr. 4a, b).Dina saringan awal, Kasus 1 ditingalikeun salaku nodul padet sareng kalsifikasi, fitur anu aya hubunganana sareng kabeungharan, sedengkeun Kasus 2 ditingalikeun salaku nodul sawaréh padet anu teu jelas sareng henteu aya fitur benign anu jelas.Tilu rounds of nurutan-up CT neang némbongkeun yén kasus ieu tetep stabil dina periode 4-taun sahingga dianggap nodules benign (Gbr. 4a).Dibandingkeun sareng evaluasi klinis tina séri CT scan, analisis métabolit sérum tunggal-shot sareng modél klasifikasi ayeuna gancang sareng leres ngaidentipikasi nodul benign ieu dumasar kana konstrain probabilistik (Table 1).Gambar 4b dina kasus 3 nunjukkeun nodul sareng tanda-tanda retraksi pleura, anu paling sering dipatalikeun sareng malignancy32.Kasus 4 dibere salaku nodul sawaréh padet indeterminate tanpa bukti sabab benign.Sadaya kasus ieu diprediksi salaku malignant numutkeun modél classifier (Table 1).Penilaian adenokarsinoma paru-paru dibuktikeun ku pamariksaan histopatologis saatos operasi reseksi paru-paru (Gbr. 4b).Pikeun set validasi éksternal, klasifikasi métabolik sacara akurat ngaramalkeun dua kasus nodul paru-paru anu teu ditangtukeun langkung ageung tibatan 6 mm (Suplemén Gambar 10).
Gambar CT tina jandela axial tina bayah dua kasus nodules benign.Dina kasus 1, CT scan sanggeus 4 taun némbongkeun nodul padet stabil ukuran 7 mm kalawan kalsifikasi dina lobus handap katuhu.Dina kasus 2, CT scan sanggeus 5 taun kaungkap stabil, nodul sawaréh padet kalayan diaméter 7 mm di lobus luhur katuhu.b Axial jandela CT gambar tina bayah jeung studi patologis pakait dua kasus tahap I adenocarcinoma saméméh resection lung.Kasus 3 ngungkabkeun nodul kalayan diaméter 8 mm di lobus luhur katuhu sareng retraksi pleura.Kasus 4 ngungkabkeun nodul kaca taneuh sawaréh padet ukuran 9 mm dina lobus luhur kénca.Hematoxylin sareng eosin (H&E) ngawarnaan jaringan paru-paru anu diréseksi (skala bar = 50 μm) nunjukkeun pola pertumbuhan acinar adenokarsinoma paru-paru.Panah nunjukkeun nodules kauninga dina gambar CT.Gambar H&E mangrupikeun gambar perwakilan tina sababaraha (> 3) widang mikroskopis anu ditaliti ku ahli patologi.
Dicokot babarengan, hasil kami demonstrate nilai potensi sérum métabolit biomarkers dina diagnosis diferensial of nodules pulmonal, nu bisa pasang aksi tantangan nalika evaluating CT screening.
Dumasar panel métabolit diferensial anu disahkeun, kami narékahan pikeun ngaidentipikasi korélasi biologis tina parobahan métabolik utama.Analisis pengayaan jalur KEGG ku MetaboAnalyst dicirikeun 6 jalur umum anu dirobah sacara signifikan antara dua kelompok anu dipasihkeun (LA vs HC sareng LA vs BN, disaluyukeun p ≤ 0.001, pangaruh> 0.01).Parobahan ieu dicirikeun ku gangguan dina métabolisme piruvat, métabolisme triptofan, métabolisme niasin sareng nikotinamida, glikolisis, siklus TCA, sareng métabolisme purin (Gbr. 5a).Urang teras salajengna ngalaksanakeun metabolomics sasaran pikeun pariksa parobahan utama ngagunakeun kuantifikasi mutlak.Penentuan métabolit umum dina jalur anu biasa dirobah ku triple quadrupole mass spectrometry (QQQ) ngagunakeun standar métabolit otentik.Karakteristik demografi tina sampel target ulikan metabolomics anu kaasup dina Suplemén Table 4. Konsisten jeung hasil metabolomics global urang, analisis kuantitatif dikonfirmasi yén hypoxanthine na xanthine, piruvat, sarta laktat anu ngaronjat di LA dibandingkeun BN na HC (Gbr. 5b, c, p <0,05).Sanajan kitu, teu aya béda anu signifikan dina métabolit ieu kapanggih antara BN jeung HC.
Analisis pengayaan jalur KEGG tina métabolit anu béda sacara signifikan dina grup LA dibandingkeun sareng grup BN sareng HC.Globaltest dua-buntut dianggo, sareng nilai p disaluyukeun nganggo metode Holm-Bonferroni (disaluyukeun p ≤ 0,001 sareng ukuran pangaruh> 0,01).b-d Plot biola nunjukkeun tingkat hypoxanthine, xanthine, laktat, piruvat, sareng triptofan dina sérum HC, BN, sareng LA ditangtukeun ku LC-MS / MS (n = 70 per grup).Garis titik-titik bodas sareng hideung nunjukkeun median sareng kuartil, masing-masing.e Biola plot némbongkeun dinormalisasi Log2TPM (transkrip per juta) mRNA ekspresi SLC7A5 na QPRT dina adenocarcinoma paru (n = 513) dibandingkeun jaringan paru normal (n = 59) dina dataset LUAD-TCGA.Kotak bodas ngagambarkeun rentang interquartile, garis hideung horizontal di tengah ngagambarkeun median, sarta garis hideung nangtung ngalegaan ti kotak ngagambarkeun 95% interval kapercayaan (CI).f Plot korelasi Pearson tina SLC7A5 sareng ekspresi GAPDH dina adenocarcinoma paru (n = 513) sareng jaringan paru-paru normal (n = 59) dina susunan data TCGA.Wewengkon abu ngagambarkeun 95% CI.r, Koéfisién korelasi Pearson.g Normalisasi tingkat triptofan sélular dina sél A549 transfected kalawan kontrol shRNA nonspecific (NC) jeung shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ditangtukeun ku LC-MS / MS.Analisis statistik lima sampel bebas biologis dina unggal grup dibere.h Tingkat sélular NADt (total NAD, kalebet NAD + sareng NADH) dina sél A549 (NC) sareng sél A549 knockdown SLC7A5 (Sh1, Sh2).Analisis statistik tilu sampel bebas biologis dina unggal grup dibere.aktivitas Glikolitik sél A549 saméméh jeung sanggeus knockdown SLC7A5 diukur ku laju acidification extracellular (ECAR) (n = 4 sampel bebas biologis per grup).2-DG, 2-déoksi-D-glukosa.Tés t Siswa dua buntut digunakeun dina (b–h).Dina (g-i), bar kasalahan ngagambarkeun rata-rata ± SD, unggal percobaan dilaksanakeun tilu kali sacara mandiri sareng hasilna sami.Data sumber disayogikeun dina wangun file data sumber.
Mertimbangkeun dampak signifikan tina métabolisme triptofan dirobah dina grup LA, kami ogé ditaksir tingkat triptofan sérum dina grup HC, BN, sarta LA ngagunakeun QQQ.Kami mendakan yén sérum triptofan diréduksi di LA dibandingkeun sareng HC atanapi BN (p <0.001, Gambar 5d), anu konsisten sareng pamanggihan saméméhna yén tingkat triptofan anu sirkulasi langkung handap dina pasien kanker paru-paru tibatan dina kadali séhat ti kelompok kontrol33,34. ,35.Ulikan sejen ngagunakeun PET/CT tracer 11C-methyl-L-tryptophan kapanggih yén waktu ingetan sinyal triptofan dina jaringan kanker paru ngaronjat sacara signifikan dibandingkeun lesions benign atawa jaringan normal36.Kami hipotésis yén panurunan triptofan dina sérum LA tiasa nunjukkeun panyerapan triptofan aktip ku sél kanker paru-paru.
Ogé dipikanyaho yén produk ahir jalur kynurénin tina katabolisme triptofan nyaéta NAD + 37,38, anu mangrupikeun substrat penting pikeun réaksi gliseraldehida-3-fosfat sareng 1,3-bisphosphoglycerate dina glikolisis39.Nalika panilitian sateuacana museurkeun kana peran katabolisme triptofan dina pangaturan imun, urang narékahan pikeun ngajelaskeun interaksi antara disregulasi triptofan sareng jalur glikolitik anu dititénan dina pangajaran ayeuna.Solute transporter kulawarga 7 anggota 5 (SLC7A5) dipikawanoh salaku transporter triptofan43,44,45.Quinolinic acid phosphoribosyltransferase (QPRT) mangrupikeun énzim anu aya di hilir jalur kynurénin anu ngarobih asam quinolinic janten NAMN46.Inspeksi tina dataset LUAD TCGA ngungkabkeun yén duanana SLC7A5 sareng QPRT sacara signifikan ningkat dina jaringan tumor dibandingkeun sareng jaringan normal (Gbr. 5e).Paningkatan ieu dititénan dina tahap I sareng II ogé tahap III sareng IV tina adenocarcinoma paru (Gambar Tambahan 11), nunjukkeun gangguan awal dina métabolisme triptofan anu aya hubunganana sareng tumorigenesis.
Salaku tambahan, dataset LUAD-TCGA nunjukkeun korelasi positif antara SLC7A5 sareng ekspresi mRNA GAPDH dina sampel pasien kanker (r = 0.45, p = 1.55E-26, Gambar 5f).Kontras, euweuh korelasi signifikan kapanggih antara tanda tangan gén misalna dina jaringan paru normal (r = 0.25, p = 0.06, Gambar 5f).Knockdown of SLC7A5 (Suplemén Gambar 12) dina sél A549 nyata ngurangan tingkat triptofan sélular jeung NAD (H) (Gambar 5g, h), hasilna attenuated aktivitas glycolytic sakumaha diukur ku laju acidification extracellular (ECAR) (Gambar 1).5i).Ku kituna, dumasar kana parobahan métabolik dina sérum jeung deteksi in vitro, urang hipotésis yén métabolisme triptofan bisa ngahasilkeun NAD + ngaliwatan jalur kynurenine sarta maénkeun peran penting dina promosi glikolisis dina kanker paru.
Studi geus ditémbongkeun yén angka nu gede ngarupakeun nodules pulmonal indeterminate kauninga ku LDCT bisa ngakibatkeun kabutuhan pikeun nguji tambahan kayaning pepet-CT, biopsy lung, sarta overtreatment alatan hiji diagnosis palsu-positip tina malignancy.31 Salaku ditémbongkeun dina Gambar 6, ulikan kami ngaidentipikasi panel métabolit sérum kalawan nilai diagnostik poténsi nu bisa ngaronjatkeun stratifikasi resiko jeung manajemén saterusna nodules pulmonal kauninga ku CT.
Nodul pulmonal dievaluasi ngagunakeun low-dosis computed tomography (LDCT) kalayan fitur pencitraan sugestif sabab benign atanapi malignant.Hasil anu teu pasti tina nodul tiasa nyababkeun kunjungan anu sering, campur tangan anu teu perlu, sareng overtreatment.Inklusi klasifikasi métabolik sérum kalayan nilai diagnostik tiasa ningkatkeun penilaian résiko sareng ngokolakeun nodul pulmonal salajengna.PET positron émisi tomography.
Data tina ulikan NLST AS jeung ulikan Éropa NELSON nunjukkeun yén screening grup-resiko tinggi kalawan low-dosis diitung tomography (LDCT) bisa ngurangan mortality kanker paru1,3.Sanajan kitu, assessment resiko jeung manajemén klinis saterusna tina angka nu gede ngarupakeun nodules pulmonal incidental kauninga ku LDCT tetep paling nangtang.Tujuan utama nyaéta pikeun ngaoptimalkeun klasifikasi anu leres tina protokol basis LDCT anu tos aya ku ngalebetkeun biomarker anu dipercaya.
biomarker molekular tangtu, kayaning métabolit getih, geus diidentipikasi ku ngabandingkeun kanker paru kalawan controls séhat15,17.Dina ulikan ayeuna, urang fokus kana aplikasi analisis métabolomik sérum pikeun ngabedakeun antara nodules pulmonal benign na malignant saliwatan kauninga ku LDCT.Kami ngabandingkeun métabolisme sérum global kontrol séhat (HC), nodul paru-paru benign (BN), sareng sampel adenocarcinoma paru-paru tahap I (LA) nganggo analisis UPLC-HRMS.Kami mendakan yén HC sareng BN ngagaduhan profil métabolik anu sami, sedengkeun LA nunjukkeun parobihan anu signifikan dibandingkeun sareng HC sareng BN.Kami ngaidentipikasi dua sét métabolit sérum anu ngabédakeun LA tina HC sareng BN.
Skéma idéntifikasi dumasar-LDCT ayeuna pikeun nodul benign sareng malignant utamana dumasar kana ukuran, kapadetan, morfologi sareng laju pertumbuhan nodul dina waktosna30.Panaliti saméméhna nunjukkeun yén ukuran nodul raket patalina sareng kamungkinan kanker paru-paru.Malah dina pasien anu résiko luhur, résiko malignancy dina titik <6 mm nyaéta <1%.Résiko malignancy pikeun nodul anu ukuranana 6 dugi ka 20 mm kisaran ti 8% dugi ka 64% 30.Ku alatan éta, Fleischner Society nyarankeun diaméter cutoff 6 mm pikeun rutin CT nurutan-up.29 Sanajan kitu, assessment resiko na manajemen nodules pulmonal indeterminate (IPN) leuwih badag batan 6 mm teu acan dilaksanakeun adequately 31 .Manajemén panyakit jantung bawaan ayeuna biasana dumasar kana ngantosan waspada sareng sering ngawaskeun CT.
Dumasar kana métabolisme anu disahkeun, urang nunjukkeun pikeun kahiji kalina tumpang tindihna tanda tangan métabolisme antara jalma séhat sareng nodul benign <6 mm.Kasaruaan biologis konsisten sareng papanggihan CT saméméhna yén résiko malignancy pikeun nodul <6 mm sahandapeun subjék tanpa nodes.30 Ieu kudu dicatet yén hasil urang ogé demonstrate yén nodules benign <6 mm sarta ≥6 mm boga tinggi. kasaruaan dina profil métabolik, nunjukkeun yén definisi fungsional etiologi benign konsisten henteu paduli ukuran nodul.Ku kituna, panels métabolit sérum diagnostik modern bisa nyadiakeun assay tunggal salaku test aturan-kaluar lamun nodul mimitina dideteksi dina CT sarta berpotensi ngurangan monitoring serial.Dina waktu nu sarua, panel sarua biomarkers métabolik dibédakeun nodules malignant ≥6 mm dina ukuran tina nodules benign sarta disadiakeun prediksi akurat pikeun IPNs ukuranana sarupa jeung fitur morfologis ambigu dina gambar CT.Klasifikasi métabolisme sérum ieu ngalaksanakeun saé dina ngaramalkeun keganasan nodul ≥6 mm kalayan AUC 0,927.Dihijikeun, hasil kami nunjukkeun yén tanda tangan métabolik sérum anu unik tiasa sacara khusus ngagambarkeun parobahan métabolik anu disababkeun ku tumor awal sareng gaduh nilai poténsial salaku prediktor résiko, henteu gumantung kana ukuran nodul.
Utamana, adenocarcinoma paru (LUAD) sareng karsinoma sél skuamosa (LUSC) mangrupikeun jinis utama kanker paru sél non-leutik (NSCLC).Nunjukkeun yen LUSC niatna pakait sareng pamakéan bako47 sarta LUAD nyaeta histology paling umum tina nodules paru incidental kauninga dina CT screening48, model classifier kami ieu husus diwangun pikeun tahap I sampel adenocarcinoma.Wang sareng rekan-rekan ogé museurkeun kana LUAD sareng ngaidentipikasi salapan tanda tangan lipid nganggo lipidomics pikeun ngabédakeun kanker paru-paru tahap awal ti individu séhat17.Kami nguji modél classifier ayeuna dina 16 kasus tahap I LUSC sareng 74 nodul benign sareng niténan akurasi prediksi LUSC anu rendah (AUC 0.776), nunjukkeun yén LUAD sareng LUSC tiasa gaduh tanda tangan métabolik sorangan.Mémang, LUAD sareng LUSC parantos kabuktian béda dina étiologi, asal biologis sareng aberasi genetik49.Ku alatan éta, tipe séjén histology kudu kaasup kana model latihan pikeun deteksi dumasar populasi kanker paru dina program screening.
Di dieu, urang ngaidentipikasi genep jalur anu paling sering dirobih dina adenokarsinoma paru dibandingkeun sareng kadali séhat sareng nodul benign.Xanthine sareng hypoxanthine mangrupikeun métabolit umum tina jalur métabolik purin.Konsisten jeung hasil urang, perantara pakait sareng métabolisme purin ngaronjat sacara signifikan dina sérum atawa jaringan pasien kalayan adenocarcinoma paru dibandingkeun jeung kadali séhat atawa penderita dina tahap preinvasive15,50.Paningkatan tingkat xanthine sareng hypoxanthine sérum tiasa nunjukkeun anabolisme anu diperyogikeun ku sél kanker anu gancang proliferasi.Disregulasi métabolisme glukosa mangrupikeun ciri khas métabolisme kanker51.Di dieu, urang katalungtik kanaékan signifikan dina piruvat sareng laktat dina grup LA dibandingkeun sareng grup HC sareng BN, anu konsisten sareng laporan saméméhna ngeunaan abnormalitas jalur glikolitik dina profil métabolisme sérum pasien kanker paru sél non-leutik (NSCLC) sareng kadali cageur.hasilna konsisten52,53.
Anu penting, urang niténan korelasi tibalik antara métabolisme piruvat sareng triptofan dina sérum adenokarsinoma paru-paru.Tingkat triptofan sérum diréduksi dina grup LA dibandingkeun sareng grup HC atanapi BN.Narikna, ulikan skala badag saméméhna ngagunakeun cohort prospektif kapanggih yén tingkat low of tryptophan sirkulasi anu pakait sareng ngaronjat resiko kanker paru 54.Tryptophan mangrupikeun asam amino ésénsial anu sapinuhna urang kéngingkeun tina dahareun.Urang nyimpulkeun yén sérum tryptophan depletion dina adenocarcinoma paru bisa ngagambarkeun depletion gancang tina métabolit ieu.Perlu dipikanyaho yén produk ahir katabolisme triptofan ngalangkungan jalur kynurenine mangrupikeun sumber sintésis de novo NAD +.Kusabab NAD + dihasilkeun utamana ngaliwatan jalur salvage, pentingna NAD + dina métabolisme triptofan dina kaséhatan sarta panyakit tetep kudu ditangtukeun46.Analisis kami tina database TCGA némbongkeun yén éksprési triptofan transporter solute transporter 7A5 (SLC7A5) ngaronjat sacara signifikan dina adenocarcinoma paru dibandingkeun jeung kadali normal sarta positif correlated kalawan éksprési énzim glycolytic GAPDH.Panaliti saméméhna utamina museurkeun kana peran katabolisme triptofan dina ngahambat réspon imun antitumor40,41,42.Di dieu urang nunjukkeun yén inhibisi uptake triptofan ku knockdown SLC7A5 dina sél kanker paru-paru nyababkeun panurunan salajengna dina tingkat NAD sélular sareng atenuasi sakaligus tina kagiatan glikolitik.Kasimpulanana, ulikan kami nyadiakeun dasar biologis pikeun parobahan métabolisme sérum pakait sareng transformasi malignant of adenocarcinoma paru.
Mutasi EGFR mangrupikeun mutasi supir anu paling umum dina pasien kalayan NSCLC.Dina ulikan urang, urang manggihan yén penderita mutasi EGFR (n = 41) miboga propil métabolik sakabéh sarupa penderita liar-tipe EGFR (n = 31), sanajan urang kapanggih turun tingkat sérum sababaraha penderita mutant EGFR di penderita acylcarnitine.Fungsi acylcarnitines anu ditetepkeun nyaéta ngangkut gugus asil tina sitoplasma kana matriks mitokondria, ngarah kana oksidasi asam lemak pikeun ngahasilkeun énergi 55 .Konsisten jeung papanggihan urang, ulikan panganyarna ogé ngaidentipikasi propil métabolisme sarupa antara EGFR mutant na EGFR tipe liar tumor ku analisa metabolom global 102 sampel jaringan adenocarcinoma paru50.Narikna, eusi acylcarnitine ogé kapanggih dina grup mutant EGFR.Ku alatan éta, naha parobahan tingkat acylcarnitine ngagambarkeun parobahan métabolik EGFR-ngainduksi jeung jalur molekular kaayaan bisa istighfar ulikan salajengna.
Dina kacindekan, ulikan urang ngadegkeun hiji classifier métabolik sérum pikeun diagnosis diferensial of nodules pulmonal jeung proposes a workflow nu bisa ngaoptimalkeun assessment resiko na mempermudah manajemén klinis dumasar kana screening CT scan.
Panaliti ieu disatujuan ku Komite Etika Rumah Sakit Kanker Universitas Sun Yat-sen, Rumah Sakit Gabungan Kahiji Universitas Sun Yat-sen, sareng Komite Etika Rumah Sakit Kanker Universitas Zhengzhou.Dina panemuan sareng grup validasi internal, 174 sera ti individu séhat sareng 244 sera tina nodul benign dikumpulkeun ti individu anu ngalaman pamariksaan médis taunan di Departemen Kontrol sareng Pencegahan Kanker, Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen, sareng 166 nodul benign.sérum.Adenokarsinoma paru tahap I dikumpulkeun ti Sun Yat-sen University Cancer Center.Dina kohort validasi éksternal, aya 48 kasus nodules benign, 39 kasus adenocarcinoma paru tahap I ti Rumah Sakit Affiliate Kahiji Universitas Sun Yat-sen, sarta 24 kasus adenocarcinoma paru tahap I ti Rumah Sakit Kangker Zhengzhou.Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen ogé ngumpulkeun 16 kasus kanker paru-paru sél skuamosa tahap I pikeun nguji kamampuan diagnostik tina klasifikasi métabolik anu diadegkeun (ciri pasien dipidangkeun dina Tabel Tambahan 5).Sampel tina kohort panemuan sareng kohort validasi internal dikumpulkeun antara Januari 2018 sareng Méi 2020. Sampel pikeun kohort validasi éksternal dikumpulkeun antara Agustus 2021 sareng Oktober 2022. Pikeun ngaleutikan bias gender, kira-kira jumlah kasus lalaki sareng awéwé ditugaskeun pikeun masing-masing. kohort.Tim Papanggihan jeung Tim Review internal.Gender pamilon ditangtukeun dumasar kana laporan diri.Informed idin dicandak ti sakabéh pamilon sarta euweuh santunan ieu disadiakeun.Subjék kalawan nodules benign éta maranéhanana kalayan skor CT scan stabil dina 2 mun 5 taun dina waktu analisis, iwal 1 kasus tina sampel validasi éksternal, nu dikumpulkeun preoperatively sarta didiagnosis ku histopatologi.Iwal bronchitis kronis.Kasus adenocarcinoma paru-paru dikumpulkeun sateuacan reseksi paru-paru sareng dikonfirmasi ku diagnosis patologis.Sampel getih puasa dikumpulkeun dina tabung pemisahan sérum tanpa antikoagulan.Sampel getih dikulub salami 1 jam dina suhu kamar teras disentrifugasi dina 2851 × g salami 10 menit dina suhu 4 ° C pikeun ngumpulkeun supernatan sérum.Alikuot sérum beku dina -80 ° C dugi ékstraksi métabolit.Departemen Pencegahan Kanker sareng Ujian Médis Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen ngumpulkeun sérum tina 100 donor séhat, kalebet jumlah lalaki sareng awéwé anu sami umur 40 dugi ka 55 taun.Volume sarua unggal sampel donor dicampurkeun, pool hasilna ieu aliquoted tur disimpen dina -80 ° C.Campuran sérum dianggo salaku bahan rujukan pikeun kadali kualitas sareng standarisasi data.
Sérum rujukan sareng sampel tés dilebur sareng métabolit diekstrak nganggo metode ékstraksi gabungan (MTBE / métanol / cai) 56 .Sakeudeung, 50 μl sérum dicampurkeun jeung 225 μl métanol és-tiis jeung 750 μl és-tiis métil tert-butil éter (MTBE).Aduk campuran jeung incubate dina és salila 1 jam.Sampel lajeng dicampurkeun jeung vortex dicampurkeun jeung 188 μl cai MS-grade ngandung standar internal (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine, sarta 13C6-isoleucine, dibeuli ti Cambridge Isotop Laboratorium).Campuran ieu lajeng centrifuged dina 15.000 × g pikeun 10 mnt dina 4 ° C, sarta fase handap ieu dipindahkeun kana dua tabung (masing-masing 125 μL) pikeun analisis LC-MS dina modeu positif jeung négatip.Tungtungna, sampel ieu ngejat nepi ka kagaringan dina-speed tinggi vakum concentrator.
Métabolit garing dikonstitusi deui dina 120 μl 80% acetonitrile, vortexed pikeun 5 mnt, sareng disentrifugasi dina 15.000 × g salami 10 mnt dina 4 ° C.Supernatants ditransferkeun kana vials kaca Amber kalawan microinserts pikeun studi metabolomics.Analisis metabolomik anu teu disasarkeun dina platform spéktrométri massa-resolusi luhur kromatografi cair ultra-kinerja (UPLC-HRMS).Métabolit dipisahkeun nganggo sistem Dionex Ultimate 3000 UPLC sareng kolom ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters).Dina mode ion positip, fase gerakna nyaéta 95% (A) sareng 50% asetonitril (B), masing-masing ngandung 10 mmol/L amonium asétat sareng 0,1% asam format.Dina modeu négatip, fase mobile A jeung B ngandung masing-masing 95% jeung 50% acetonitrile, duanana fase ngandung 10 mmol / L amonium asétat, pH = 9. Program gradién éta kieu: 0-0.5 mnt, 2% B;0,5–12 mnt, 2–50% B;12–14 mnt, 50–98% B;14–16 mnt, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16.1-20 mnt, 2% B. kolom ieu dijaga dina 40 ° C jeung sampel dina 10 ° C dina autosampler nu.Laju aliran éta 0,3 ml / mnt, volume suntik éta 3 μl.Spéktrométer massa Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) kalayan sumber ionisasi electrospray (ESI) dioperasikeun dina modeu scan lengkep sareng gandeng sareng mode ngawaskeun ddMS2 pikeun ngumpulkeun data anu ageung.Parameter MS disetél kieu: tegangan semprot +3.8 kV/- 3.2 kV, suhu kapilér 320°C, gas shielding 40 arb, gas bantu 10 arb, suhu pamanas usik 350°C, rentang scanning 70-1050 m / h, resolusi.70 000. Data dicandak ngagunakeun Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Pikeun meunteun kualitas data, sampel kontrol kualitas pooled (QC) dihasilkeun ku nyoplokkeun 10 μL aliquots tina supernatant ti unggal sampel.Genep suntikan sampel kontrol kualitas dianalisis dina awal runtuyan analitik pikeun meunteun stabilitas sistem UPLC-MS.Sampel kontrol kualitas teras diwanohkeun sacara périodik kana angkatan.Sadaya 11 bets sampel sérum dina ulikan ieu dianalisis ku LC-MS.Aliquots tina campuran kolam renang sérum ti 100 donor cageur dipaké salaku bahan rujukan dina bets masing-masing pikeun ngawas prosés ékstraksi tur saluyukeun pikeun épék bets-to-angkatan.Analisis metabolomics untargeted tina cohort kapanggihna, cohort validasi internal, sarta cohort validasi éksternal dipigawé di Metabolomics Center of Sun Yat-sen University.Laboratorium éksternal Universitas Téknologi Analisis sareng Pusat Tés Guangdong ogé nganalisis 40 conto tina cohort éksternal pikeun nguji kinerja modél classifier.
Saatos ékstraksi sareng rekonstitusi, kuantitas mutlak métabolit sérum diukur nganggo spéktrométri massa kromatografi-tandem cair kinerja ultra-tinggi (Agilent 6495 triple quadrupole) kalayan sumber ionisasi electrospray (ESI) dina modeu ngawaskeun sababaraha réaksi (MRM).Kolom ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) dipaké pikeun misahkeun métabolit.Fase gerakna diwangun ku 90% (A) jeung 5% acetonitril (B) kalawan 10 mmol/L amonium asétat jeung 0,1% larutan amonia.Program gradién nyaéta kieu: 0-1,5 mnt, 0% B;1,5–6,5 mnt, 0–15% B;6,5–8 mnt, 15% B;8–8,5 mnt, 15%–0% B;8.5–11.5 mnt, 0%B.Kolom dijaga dina suhu 40 °C sareng sampel dina suhu 10 °C dina autosampler.Laju aliran nyaéta 0,3 mL / mnt sareng volume suntikan nyaéta 1 μL.Parameter MS diatur saperti kieu: tegangan kapilér ± 3,5 kV, tekanan nebulizer 35 psi, aliran gas malapah 12 L / mnt, suhu gas malapah 350 ° C, suhu gas drying 250 ° C, sarta aliran gas drying 14 l / mnt.Konversi MRM triptofan, piruvat, laktat, hypoxanthine sareng xanthine nyaéta 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 jeung 151.0–107.9 masing-masing.Data dikumpulkeun ngagunakeun Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Pikeun sampel sérum, triptofan, piruvat, laktat, hypoxanthine, jeung xanthine diukur maké kurva kalibrasi solusi campuran baku.Pikeun conto sél, eusi triptofan dinormalisasi kana standar internal sareng massa protéin sél.
Ekstraksi puncak (m / z sareng waktos ingetan (RT)) dilaksanakeun nganggo Compound Discovery 3.1 sareng TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Pikeun ngaleungitkeun béda poténsial antara bets, unggal puncak karakteristik sampel tés dibagi ku puncak karakteristik bahan rujukan ti bets sarua pikeun ménta kaayaanana relatif.simpangan baku relatif standar internal saméméh jeung sanggeus standarisasi ditémbongkeun dina Suplemén Table 6. Bedana antara dua grup anu dicirikeun ku laju kapanggihna palsu (FDR <0.05, Wilcoxon ditandatanganan test rank) jeung robah melu (> 1.2 atawa <0.83).Data MS atah tina fitur sasari sareng rujukan data MS anu dilereskeun sérum dipidangkeun dina Data Suplemén 1 sareng Data Suplemén 2, masing-masing.Anotasi puncak dilaksanakeun dumasar kana opat tingkatan idéntifikasi anu ditetepkeun, kalebet métabolit anu diidentifikasi, sanyawa anu ditandaan sacara putative, kelas sanyawa anu dicirian sacara putative, sareng sanyawa anu teu dipikanyaho 22.Dumasar maluruh database di Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), sanyawa biologis jeung MS / MS cocog standar disahkeun atawa annotations cocok pasti dina mzCloud (skor> 85) atawa Chemspider ahirna dipilih salaku perantara antara metabolom diferensial.Puncak annotations pikeun tiap fitur kaasup dina Data Suplemén 3. MetaboAnalyst 5.0 ieu dipaké pikeun analisis univariate tina kaayaanana métabolit sum-dinormalisasi.MetaboAnalyst 5.0 ogé ngaevaluasi analisis pengayaan jalur KEGG dumasar kana métabolit anu béda sacara signifikan.Analisis komponén poko (PCA) jeung analisis diskriminan parsial sahenteuna kuadrat (PLS-DA) dianalisis ngagunakeun pakét software ropls (v.1.26.4) kalawan normalisasi tumpukan jeung autoscaling.Modél biomarker métabolit optimal pikeun ngaduga malignancy nodule dihasilkeun maké régrési logistik binér kalawan shrinkage mutlak tur operator Pilihan pangsaeutikna (LASSO, R pakét v.4.1-3).Kinerja model diskriminan dina set deteksi na validasi dicirikeun ku estimasi AUC dumasar kana analisis ROC nurutkeun pakét pROC (v.1.18.0.).The optimal probability cutoff dicandak dumasar kana indéks Youden maksimum model (sensitipitas + spésifisitas - 1).Sampel anu nilaina kirang atanapi langkung ageung tibatan ambangna bakal diprediksi masing-masing salaku nodul benign sareng adenocarcinoma paru-paru.
Sél A549 (#CCL-185, Koléksi Budaya Tipe Amérika) ditumbuh dina medium F-12K anu ngandung 10% FBS.Sekuen RNA jepit rambut pondok (shRNA) nargétkeun SLC7A5 sareng kontrol nontargeting (NC) diselapkeun kana vektor lentiviral pLKO.1-puro.Runtuyan antisense of shSLC7A5 nyaéta kieu: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3 ′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3 ′).Antibodi pikeun SLC7A5 (# 5347) jeung tubulin (# 2148) dibeuli ti Cell Signaling Téhnologi.Antibodi pikeun SLC7A5 sareng tubulin dianggo dina éncér 1: 1000 pikeun analisis blot Kulon.
The Seahorse XF Glycolytic Stress Test ngukur tingkat acidification extracellular (ECAR).Dina assay, glukosa, oligomycin A, sareng 2-DG dikaluarkeun sacara berurutan pikeun nguji kapasitas glikolitik sélular anu diukur ku ECAR.
Sél A549 ditransféksi ku kontrol non-targeting (NC) sareng shSLC7A5 (Sh1, Sh2) dilapis sapeuting dina piring diaméterna 10 cm.Métabolit sél sasari ku 1 ml métanol cai és-tiis 80%.Sél dina leyuran métanol dikerok, dikumpulkeun kana tabung anyar, sarta disentrifugasi dina 15.000 × g salila 15 menit dina 4 ° C.Kumpulkeun 800 µl supernatant tur garing maké konsentrator vakum-speed tinggi.Pelet métabolit garing teras dianalisis pikeun tingkat triptofan nganggo LC-MS / MS sapertos anu dijelaskeun di luhur.Tingkat NAD (H) sélular dina sél A549 (NC sareng shSLC7A5) diukur nganggo kuantitatif NAD + / NADH colorimetric kit (#K337, BioVision) numutkeun petunjuk produsén.Tingkat protéin diukur pikeun tiap sampel pikeun normalisasi jumlah métabolit.
Taya métode statistik dipaké pikeun preliminarily nangtukeun ukuran sampel.Studi metabolomik saméméhna anu ditujukeun pikeun penemuan biomarker15,18 parantos dianggap salaku tolok ukur pikeun ukuran ukuran, sareng dibandingkeun sareng laporan ieu, sampel kami cekap.Henteu aya conto anu dikaluarkeun tina kohort ulikan.Sampel sérum sacara acak ditugaskeun ka grup panemuan (kasus 306, 74.6%) sareng grup validasi internal (kasus 104, 25.4%) pikeun studi metabolomik anu teu ditargetkeun.Urang ogé milih sacara acak 70 kasus ti unggal grup tina set panemuan pikeun studi metabolomics sasaran.Panyidik dilolongan kana tugas kelompok salami pendataan sareng analisa LC-MS.Analisis statistik data métabolomik sareng ékspérimén sél dijelaskeun dina masing-masing Hasil, Gambar Legenda, sareng Métode bagian.Kuantitas triptofan sélular, NADT, sareng kagiatan glikolitik dilaksanakeun tilu kali sacara mandiri kalayan hasil anu sami.
Kanggo inpo nu langkung lengkep ihwal desain ulikan, tingali Laporan Portopolio Alam Abstrak pakait sareng artikel ieu.
Data MS atah tina fitur sasari sareng data MS anu dinormalisasi tina sérum rujukan dipidangkeun dina Data Suplemén 1 sareng Data Suplemén 2, masing-masing.Anotasi puncak pikeun fitur diferensial dibere dina Data Suplemén 3. Dataset LUAD TCGA tiasa diunduh tina https://portal.gdc.cancer.gov/.Data input pikeun ngarencanakeun grafik disayogikeun dina data sumber.Sumber data disadiakeun pikeun artikel ieu.
National Lung Screening Study Group, jsb Ngurangan mortality kanker paru kalawan-dosis low diitung tomography.Inggris kalér.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR jeung Nabi, PC screening kanker paru ngagunakeun-dosis low hélik CT: hasil tina National Lung Screening Study (NLST).J. Med.Layar 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Ngurangan mortality kanker paru kalawan screening CT volumetric dina sidang randomized.Inggris kalér.J. Med.382, 503–513 (2020).
waktos pos: Sep-18-2023