Diagnosis diferensial nodul pulmonal anu diidentipikasi ku tomografi komputer (CT) tetep janten tantangan dina prakték klinis. Di dieu, urang ngacirikeun métabolom global tina 480 sampel sérum, kalebet kontrol séhat, nodul paru-paru jinak, sareng adenokarsinoma paru-paru stadium I. Adenokarsinoma nunjukkeun profil métabolom anu unik, sedengkeun nodul jinak sareng individu séhat gaduh kamiripan anu luhur dina profil métabolom. Dina grup panemuan (n = 306), sakumpulan 27 metabolit diidentipikasi pikeun ngabédakeun antara nodul jinak sareng ganas. AUC tina modél diskriminan dina validasi internal (n = 104) sareng validasi éksternal (n = 111) masing-masing nyaéta 0,915 sareng 0,945. Analisis jalur ngungkabkeun paningkatan métabolit glikolitik anu aya hubunganana sareng panurunan triptofan dina sérum adenokarsinoma paru-paru dibandingkeun sareng nodul jinak sareng kontrol séhat, sareng nunjukkeun yén serapan triptofan ngamajukeun glikolisis dina sél kanker paru-paru. Panilitian kami nyorot nilai biomarker métabolit sérum dina meunteun résiko nodul pulmonal anu dideteksi ku CT.
Diagnosis dini penting pisan pikeun ningkatkeun tingkat survival pikeun pasien kanker. Hasil tina US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) sareng European NELSON Study nunjukkeun yén skrining nganggo computed tomography dosis rendah (LDCT) tiasa ngirangan mortalitas kanker paru-paru sacara signifikan dina kelompok résiko tinggi1,2,3. Kusabab panggunaan LDCT anu nyebar pikeun skrining kanker paru-paru, insiden panemuan radiografi insidental tina nodul pulmonal asimtomatik terus ningkat4. Nodul pulmonal dihartikeun salaku opasitas fokal dugi ka 3 cm diaméterna5. Kami nyanghareupan kasusah dina meunteun kamungkinan malignansi sareng nanganan sajumlah ageung nodul pulmonal anu dideteksi sacara teu dihaja dina LDCT. Watesan CT tiasa nyababkeun seringna pamariksaan susulan sareng hasil positip palsu, anu nyababkeun intervensi sareng perawatan anu teu perlu6. Ku alatan éta, aya kabutuhan pikeun ngembangkeun biomarker anu tiasa dipercaya sareng mangpaat pikeun ngaidentipikasi kanker paru-paru sacara leres dina tahap awal sareng ngabédakeun kalolobaan nodul jinak dina deteksi awal7.
Analisis molekuler getih anu komprehensif (sérum, plasma, sél mononuklear getih periferal), kalebet génomik, protéomik atanapi metilasi DNA8,9,10, parantos nyababkeun minat anu ningkat dina panemuan biomarker diagnostik pikeun kanker paru-paru. Samentawis éta, pendekatan metabolomik ngukur produk ahir sél anu dipangaruhan ku tindakan éndogén sareng éksogén sareng ku kituna diterapkeun pikeun ngaduga awal sareng hasil panyakit. Kromatografi cair-spektrometri massa tandem (LC-MS) mangrupikeun metode anu seueur dianggo pikeun studi metabolomik kusabab sensitivitas anu luhur sareng rentang dinamis anu ageung, anu tiasa nutupan metabolit kalayan sipat fisikokimia anu béda11,12,13. Sanaos analisis metabolomik global plasma/sérum parantos dianggo pikeun ngaidentipikasi biomarker anu aya hubunganana sareng diagnosis kanker paru-paru14,15,16,17 sareng khasiat pangobatan,18 klasifikasi metabolit sérum pikeun ngabédakeun antara nodul paru-paru jinak sareng ganas masih kedah seueur ditalungtik. -panalungtikan masif.
Adenokarsinoma sareng karsinoma sél skuamosa mangrupikeun dua subtipe utama kanker paru-paru non-sél leutik (NSCLC). Rupa-rupa tés skrining CT nunjukkeun yén adenokarsinoma mangrupikeun jinis histologis kanker paru-paru anu paling umum1,19,20,21. Dina panilitian ieu, kami nganggo kromatografi cair ultra-kinerja-spektrometri massa résolusi tinggi (UPLC-HRMS) pikeun ngalaksanakeun analisis métabolomika dina total 695 sampel sérum, kalebet kontrol séhat, nodul pulmonal jinak, sareng CT-detected ≤3 cm. Skrining pikeun adenokarsinoma paru-paru Tahap I. Kami ngaidentipikasi panel metabolit sérum anu ngabédakeun adenokarsinoma paru-paru tina nodul jinak sareng kontrol séhat. Analisis pengayaan jalur ngungkabkeun yén triptofan sareng métabolisme glukosa anu teu normal mangrupikeun parobahan umum dina adenokarsinoma paru-paru dibandingkeun sareng nodul jinak sareng kontrol séhat. Pamungkas, kami ngadegkeun sareng ngavalidasi klasifikasi métabolik sérum kalayan spésifisitas sareng sensitivitas anu luhur pikeun ngabédakeun antara nodul pulmonal ganas sareng jinak anu dideteksi ku LDCT, anu tiasa ngabantosan diagnosis diferensial awal sareng penilaian résiko.
Dina panilitian ayeuna, sampel sérum anu cocog sareng jenis kelamin sareng umur dikumpulkeun sacara rétrospéktif ti 174 kontrol séhat, 292 pasien anu ngagaduhan nodul paru jinak, sareng 229 pasien anu ngagaduhan adenokarsinoma paru-paru stadium I. Karakteristik démografis tina 695 subjek dipidangkeun dina Tabel Tambahan 1.
Sakumaha anu dipidangkeun dina Gambar 1a, total 480 sampel sérum, kalebet 174 kontrol séhat (HC), 170 nodul jinak (BN), sareng 136 sampel adenokarsinoma paru-paru (LA) tahap I, dikumpulkeun di Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen. Kohort panemuan pikeun profil métabolom anu teu dituju nganggo kromatografi cair kinerja ultra-spektrometri massa résolusi tinggi (UPLC-HRMS). Sakumaha anu dipidangkeun dina Gambar Tambahan 1, metabolit diferensial antara LA sareng HC, LA sareng BN diidéntifikasi pikeun ngadegkeun modél klasifikasi sareng langkung ngajalajah analisis jalur diferensial. 104 sampel anu dikumpulkeun ku Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen sareng 111 sampel anu dikumpulkeun ku dua rumah sakit sanés masing-masing diuji validasi internal sareng éksternal.
a Populasi panilitian dina kohort panemuan anu ngalaman analisis metabolomik sérum global nganggo kromatografi cair kinerja ultra-spektrometri massa résolusi luhur (UPLC-HRMS). b Analisis diskriminan kuadrat paling saeutik parsial (PLS-DA) tina total métabolom tina 480 sampel sérum tina kohort panilitian, kalebet kontrol séhat (HC, n = 174), nodul jinak (BN, n = 170), sareng adenokarsinoma paru-paru stadium I (Los Angeles, n = 136). +ESI, modeu ionisasi éléktrospray positif, -ESI, modeu ionisasi éléktrospray négatip. c–e Métabolit kalayan jumlah anu béda sacara signifikan dina dua kelompok anu dipasihkeun (uji peringkat tandatangan Wilcoxon dua sisi, nilai p anu disaluyukeun laju panemuan palsu, FDR <0,05) dipidangkeun dina warna beureum (parobahan lipatan > 1,2) sareng biru (parobahan lipatan < 0,83). ) dipidangkeun dina grafik gunungapi. Peta panas klaster hirarkis anu nunjukkeun béda anu signifikan dina jumlah metabolit anu dibéré anotasi antara LA sareng BN. Data sumber disayogikeun dina bentuk file data sumber.
Total métabolom sérum tina 174 HC, 170 BN sareng 136 LA dina grup panemuan dianalisis nganggo analisis UPLC-HRMS. Kami mimiti nunjukkeun yén sampel kontrol kualitas (QC) ngagumpal pageuh di tengah modél analisis komponén utama (PCA) anu teu diawasi, mastikeun stabilitas kinerja panilitian ayeuna (Gambar Tambahan 2).
Sakumaha anu dipidangkeun dina analisis diskriminan kuadrat paling saeutik parsial (PLS-DA) dina Gambar 1 b, urang mendakan yén aya béda anu jelas antara LA sareng BN, LA sareng HC dina modeu ionisasi éléktrospray positif (+ESI) sareng négatip (−ESI). Nanging, teu aya béda anu signifikan anu kapanggih antara BN sareng HC dina kaayaan +ESI sareng -ESI.
Kami mendakan 382 fitur diferensial antara LA sareng HC, 231 fitur diferensial antara LA sareng BN, sareng 95 fitur diferensial antara BN sareng HC (uji pangkat anu ditandatanganan Wilcoxon, FDR <0,05 sareng parobahan sababaraha >1,2 atanapi <0,83) (Gambar .1c-e). . Puncak-puncak salajengna dibéré anotasi (Data Tambahan 3) ngalawan database (perpustakaan mzCloud/HMDB/Chemspider) dumasar kana nilai m/z, waktos ingetan sareng pamilarian spéktrum massa fragmentasi (rincian dijelaskeun dina bagian Métode) 22. Pamungkas, 33 sareng 38 metabolit anu dibéré anotasi kalayan béda anu signifikan dina jumlahna diidentifikasi pikeun LA dibandingkeun sareng BN (Gambar 1f sareng Tabel Tambahan 2) sareng LA dibandingkeun sareng HC (Gambar Tambahan 3 sareng Tabel Tambahan 2), masing-masing. Sabalikna, ngan ukur 3 metabolit kalayan béda anu signifikan dina jumlahna diidentifikasi dina BN sareng HC (Tabel Tambahan 2), saluyu sareng tumpang tindih antara BN sareng HC dina PLS-DA. Métabolit diferensial ieu ngawengku rupa-rupa biokimia (Gambar Tambahan 4). Sacara gembleng, hasil ieu nunjukkeun parobahan anu signifikan dina métabolom sérum anu ngagambarkeun transformasi ganas kanker paru-paru tahap awal dibandingkeun sareng nodul paru-paru jinak atanapi subjek anu séhat. Samentawis éta, kamiripan métabolom sérum BN sareng HC nunjukkeun yén nodul paru-paru jinak tiasa ngabagi seueur ciri biologis sareng individu anu séhat. Kusabab mutasi gén reséptor faktor pertumbuhan épidermal (EGFR) umum dina subtipe adenokarsinoma paru-paru 23, kami narékahan pikeun nangtukeun dampak mutasi supir kana métabolom sérum. Kami teras nganalisis profil métabolom sacara umum tina 72 kasus kalayan status EGFR dina grup adenokarsinoma paru-paru. Anu pikaresepeun, kami mendakan profil anu sami antara pasien mutan EGFR (n = 41) sareng pasien tipe liar EGFR (n = 31) dina analisis PCA (Gambar Tambahan 5a). Nanging, kami ngaidentipikasi 7 metabolit anu jumlahna robih sacara signifikan dina pasien anu ngagaduhan mutasi EGFR dibandingkeun sareng pasien anu ngagaduhan EGFR tipe liar (uji t, p <0,05 sareng parobahan lipatan > 1,2 atanapi <0,83) (Gambar Tambahan 5b). Mayoritas metabolit ieu (5 tina 7) nyaéta asilkarnitin, anu maénkeun peran penting dina jalur oksidasi asam lemak.
Sakumaha anu dipidangkeun dina alur kerja anu dipidangkeun dina Gambar 2 a, biomarker pikeun klasifikasi nodul diala nganggo operator penyusutan absolut pangsaeutikna sareng seleksi dumasar kana 33 metabolit diferensial anu diidentifikasi dina LA (n = 136) sareng BN (n = 170). Kombinasi variabel pangsaéna (LASSO) - modél régrési logistik binér. Validasi silang sapuluh kali lipat dianggo pikeun nguji reliabilitas modél. Seleksi variabel sareng regularisasi parameter disaluyukeun ku pinalti maksimalisasi likelihood kalayan parameter λ24. Analisis metabolomik global salajengna dilaksanakeun sacara mandiri dina grup validasi internal (n = 104) sareng validasi éksternal (n = 111) pikeun nguji kinerja klasifikasi modél diskriminan. Hasilna, 27 metabolit dina set panemuan diidentifikasi salaku modél diskriminan pangsaéna kalayan nilai AUC rata-rata panggedéna (Gambar 2b), di antarana 9 ngagaduhan aktivitas anu ningkat sareng 18 aktivitas anu turun dina LA dibandingkeun sareng BN (Gambar 2c).
Alur kerja pikeun ngawangun klasifikasi nodul pulmonal, kalebet milih panel metabolit sérum anu pangsaéna dina set panemuan nganggo modél régrési logistik binér ngalangkungan validasi silang sapuluh kali lipat sareng meunteun kinerja prédiktif dina set validasi internal sareng éksternal. b Statistik validasi silang modél régrési LASSO pikeun pamilihan biomarker métabolik. Angka-angka anu dipasihkeun di luhur ngagambarkeun jumlah rata-rata biomarker anu dipilih dina λ anu dipasihkeun. Garis putus-putus beureum ngagambarkeun nilai AUC rata-rata dina lambda anu saluyu. Batang kasalahan kulawu ngagambarkeun nilai AUC minimum sareng maksimum. Garis putus-putus nunjukkeun modél anu pangsaéna kalayan 27 biomarker anu dipilih. AUC, daérah di handapeun kurva karakteristik operasi panarima (ROC). c Parobahan lipatan 27 metabolit anu dipilih dina grup LA dibandingkeun sareng grup BN dina grup panemuan. Kolom beureum - aktivasi. Kolom biru mangrupikeun panurunan. d - f Kurva karakteristik operasi panarima (ROC) anu nunjukkeun kakuatan modél diskriminan dumasar kana 27 kombinasi metabolit dina set validasi panemuan, internal, sareng éksternal. Data sumber disayogikeun dina bentuk file data sumber.
Modél prediksi dijieun dumasar kana koéfisién régrési tertimbang tina 27 metabolit ieu (Tabel Tambahan 3). Analisis ROC dumasar kana 27 metabolit ieu ngahasilkeun nilai area di handapeun kurva (AUC) 0,933, sensitivitas grup panemuan nyaéta 0,868, sareng spésifisitas nyaéta 0,859 (Gambar 2d). Samentawis éta, di antara 38 metabolit diferensial anu dibéré anotasi antara LA sareng HC, sakumpulan 16 metabolit ngahontal AUC 0,902 kalayan sensitivitas 0,801 sareng spésifisitas 0,856 dina ngabédakeun LA tina HC (Gambar Tambahan 6a-c). Nilai AUC dumasar kana ambang parobahan lipatan anu béda pikeun metabolit diferensial ogé dibandingkeun. Kami mendakan yén modél klasifikasi ngalakukeun anu pangsaéna dina ngabédakeun antara LA sareng BN (HC) nalika tingkat parobahan lipatan disetel ka 1,2 dibandingkeun 1,5 atanapi 2,0 (Gambar Tambahan 7a,b). Modél klasifikasi, dumasar kana 27 grup metabolit, salajengna divalidasi dina kohort internal sareng éksternal. AUC nyaéta 0,915 (sensitivitas 0,867, spésifisitas 0,811) pikeun validasi internal sareng 0,945 (sensitivitas 0,810, spésifisitas 0,979) pikeun validasi éksternal (Gambar 2e, f). Pikeun meunteun efisiensi antar laboratorium, 40 sampel tina kohort éksternal dianalisis di laboratorium éksternal sapertos anu dijelaskeun dina bagian Métode. Akurasi klasifikasi ngahontal AUC 0,925 (Gambar Tambahan 8). Kusabab karsinoma sél skuamosa paru-paru (LUSC) mangrupikeun subtipe kanker paru-paru non-sél leutik (NSCLC) anu paling umum kadua saatos adenokarsinoma paru-paru (LUAD), kami ogé nguji poténsi utilitas profil métabolik anu divalidasi. BN sareng 16 kasus LUSC. AUC diskriminasi antara LUSC sareng BN nyaéta 0,776 (Gambar Tambahan 9), nunjukkeun kamampuan anu langkung goréng dibandingkeun sareng diskriminasi antara LUAD sareng BN.
Panilitian nunjukkeun yén ukuran nodul dina gambar CT berkorelasi positif sareng kamungkinan malignansi sareng tetep janten faktor penentu utama perawatan nodul25,26,27. Analisis data tina kohort ageung tina panilitian skrining NELSON nunjukkeun yén résiko malignansi dina subjek anu gaduh nodul <5 mm bahkan sami sareng dina subjek anu henteu gaduh nodul 28. Ku alatan éta, ukuran minimum anu meryogikeun pemantauan CT rutin nyaéta 5 mm, sakumaha anu disarankeun ku British Thoracic Society (BTS), sareng 6 mm, sakumaha anu disarankeun ku Fleischner Society 29. Nanging, nodul anu langkung ageung tibatan 6 mm sareng tanpa fitur jinak anu jelas, anu disebut nodul pulmonal indeterminate (IPN), tetep janten tantangan utama dina évaluasi sareng manajemen dina prakték klinis30,31. Salajengna kami nalungtik naha ukuran nodul mangaruhan tanda tangan métabolom nganggo sampel anu dikumpulkeun tina kohort panemuan sareng validasi internal. Fokus kana 27 biomarker anu divalidasi, kami mimitina ngabandingkeun profil PCA tina métabolom HC sareng BN sub-6 mm. Kami mendakan yén kalolobaan titik data pikeun HC sareng BN tumpang tindih, nunjukkeun yén tingkat metabolit sérum sami dina dua kelompok (Gambar 3a). Peta fitur dina rentang ukuran anu béda tetep dilestarikan dina BN sareng LA (Gambar 3b, c), sedengkeun pamisahan dititénan antara nodul ganas sareng jinak dina rentang 6-20 mm (Gambar 3d). Kohort ieu ngagaduhan AUC 0,927, spésifisitas 0,868, sareng sensitivitas 0,820 pikeun ngaduga keganasan nodul anu ukuranana 6 dugi ka 20 mm (Gambar 3e, f). Hasil kami nunjukkeun yén klasifikasi tiasa nangkep parobahan métabolik anu disababkeun ku transformasi ganas awal, henteu paduli ukuran nodul.
ad Babandingan profil PCA antara grup anu ditangtukeun dumasar kana klasifikasi métabolik 27 metabolit. CC sareng BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. dina LA 6–20 mm dibandingkeun LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm sareng LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Kurva karakteristik operasi panarima (ROC) anu nunjukkeun kinerja modél diskriminan pikeun nodul 6–20 mm. f Nilai probabilitas diitung dumasar kana modél régrési logistik pikeun nodul anu ukuranana 6–20 mm. Garis putus-putus kulawu ngagambarkeun nilai cutoff optimal (0,455). Angka-angka di luhur ngagambarkeun perséntase kasus anu diproyeksikan pikeun Los Angeles. Anggo uji t Student dua sisi. PCA, analisis komponén utama. Daérah AUC di handapeun kurva. Data sumber disayogikeun dina bentuk file data sumber.
Opat sampel (umur 44–61 taun) kalayan ukuran nodul pulmonal anu sami (7–9 mm) salajengna dipilih pikeun ngagambarkeun kinerja modél prediksi malignansi anu diusulkeun (Gambar 4a, b). Dina panyaringan awal, Kasus 1 dipidangkeun salaku nodul padet kalayan kalsifikasi, fitur anu aya hubunganana sareng jinak, sedengkeun Kasus 2 dipidangkeun salaku nodul padet parsial anu teu ditangtukeun tanpa fitur jinak anu jelas. Tilu puteran scan CT susulan nunjukkeun yén kasus ieu tetep stabil salami periode 4 taun sareng ku kituna dianggap nodul jinak (Gambar 4a). Dibandingkeun sareng évaluasi klinis scan CT serial, analisis metabolit sérum single-shot kalayan modél klasifikasi ayeuna gancang sareng leres ngaidentipikasi nodul jinak ieu dumasar kana kendala probabilistik (Tabel 1). Gambar 4b dina kasus 3 nunjukkeun nodul kalayan tanda-tanda retraksi pleura, anu paling sering dikaitkeun sareng malignansi32. Kasus 4 dipidangkeun salaku nodul padet parsial anu teu ditangtukeun tanpa bukti panyabab jinak. Sadaya kasus ieu diprediksi ganas numutkeun modél klasifikasi (Tabel 1). Penilaian adenokarsinoma paru-paru dipidangkeun ku pamariksaan histopatologis saatos operasi réseksi paru-paru (Gambar 4b). Pikeun set validasi éksternal, klasifikasi métabolik sacara akurat ngaduga dua kasus nodul paru-paru anu teu ditangtukeun anu langkung ageung tibatan 6 mm (Gambar Tambahan 10).
Gambar CT tina jandela aksial paru-paru tina dua kasus nodul jinak. Dina kasus 1, CT scan saatos 4 taun nunjukkeun nodul padet anu stabil ukuran 7 mm kalayan kalsifikasi dina lobus handap katuhu. Dina kasus 2, CT scan saatos 5 taun ngungkabkeun nodul anu stabil, sawaréh padet kalayan diaméter 7 mm dina lobus luhur katuhu. b Gambar CT jandela aksial paru-paru sareng studi patologis anu saluyu tina dua kasus adenokarsinoma stadium I sateuacan réseksi paru-paru. Kasus 3 ngungkabkeun nodul kalayan diaméter 8 mm dina lobus luhur katuhu kalayan rétraksi pleura. Kasus 4 ngungkabkeun nodul ground-glass sawaréh padet ukuran 9 mm dina lobus luhur kénca. Pewarnaan hematoxylin sareng eosin (H&E) tina jaringan paru-paru anu direseksi (skala bar = 50 μm) nunjukkeun pola pertumbuhan asinar adenokarsinoma paru-paru. Panah nunjukkeun nodul anu dideteksi dina gambar CT. Gambar H&E mangrupikeun gambar anu ngawakilan sababaraha (>3) widang mikroskopis anu dipariksa ku ahli patologi.
Sacara gembleng, hasil panalungtikan nunjukkeun nilai poténsial biomarker metabolit sérum dina diagnosis diferensial nodul pulmonal, anu tiasa nyababkeun tantangan nalika meunteun skrining CT.
Dumasar kana panel metabolit diferensial anu divalidasi, kami narékahan pikeun ngaidentipikasi korelasi biologis tina parobahan métabolik utama. Analisis pangayaan jalur KEGG ku MetaboAnalyst ngaidentipikasi 6 jalur umum anu robih sacara signifikan antara dua kelompok anu dipasihkeun (LA vs. HC sareng LA vs. BN, disaluyukeun p ≤ 0,001, pangaruh > 0,01). Parobihan ieu dicirikeun ku gangguan dina métabolisme piruvat, métabolisme triptofan, métabolisme niasin sareng nikotinamida, glikolisis, siklus TCA, sareng métabolisme purin (Gambar 5a). Kami teras ngalaksanakeun métabolomika anu dituju pikeun mastikeun parobahan utama nganggo kuantifikasi absolut. Nangtukeun métabolit umum dina jalur anu robih sacara umum ku spéktrométri massa triple quadrupole (QQQ) nganggo standar métabolit anu asli. Karakteristik démografi tina sampel target studi métabolomik kalebet dina Tabel Tambahan 4. Saluyu sareng hasil métabolomik global kami, analisis kuantitatif mastikeun yén hipoksantin sareng xantin, piruvat, sareng laktat ningkat dina LA dibandingkeun sareng BN sareng HC (Gambar 5b, c, p <0,05). Nanging, teu aya béda anu signifikan dina metabolit ieu anu kapendak antara BN sareng HC.
Analisis pangayaan jalur KEGG tina metabolit anu béda sacara signifikan dina grup LA dibandingkeun sareng grup BN sareng HC. Globaltest dua sisi dianggo, sareng nilai p disaluyukeun nganggo metode Holm-Bonferroni (disaluyukeun p ≤ 0,001 sareng ukuran épék > 0,01). b–d Plot biola anu nunjukkeun kadar hipoksantin, xantin, laktat, piruvat, sareng triptofan dina sérum HC, BN, sareng LA ditangtukeun ku LC-MS/MS (n = 70 per grup). Garis putus-putus bodas sareng hideung nunjukkeun median sareng kuartil, masing-masing. e Plot biola anu nunjukkeun éksprési mRNA Log2TPM (transkrip per juta) anu dinormalisasi tina SLC7A5 sareng QPRT dina adenokarsinoma paru-paru (n = 513) dibandingkeun sareng jaringan paru-paru normal (n = 59) dina sét data LUAD-TCGA. Kotak bodas ngagambarkeun rentang interkuartil, garis hideung horizontal di tengah ngagambarkeun median, sareng garis hideung vertikal anu manjang ti kotak ngagambarkeun interval kapercayaan 95% (CI). f Plot korelasi Pearson tina éksprési SLC7A5 sareng GAPDH dina adenokarsinoma paru-paru (n = 513) sareng jaringan paru-paru normal (n = 59) dina sét data TCGA. Daérah kulawu ngagambarkeun 95% CI. r, koéfisién korelasi Pearson. g Kadar triptofan sélular anu dinormalisasi dina sél A549 anu ditransfeksi ku kontrol shRNA nonspésifik (NC) sareng shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ditangtukeun ku LC-MS/MS. Analisis statistik lima sampel anu mandiri sacara biologis dina unggal kelompok dipidangkeun. h Kadar sélular NADt (total NAD, kalebet NAD+ sareng NADH) dina sél A549 (NC) sareng sél A549 knockdown SLC7A5 (Sh1, Sh2). Analisis statistik tilu sampel anu mandiri sacara biologis dina unggal kelompok dipidangkeun. Aktivitas glikolitik sél A549 sateuacan sareng saatos knockdown SLC7A5 diukur ku laju asidifikasi ekstrasélular (ECAR) (n = 4 sampel anu mandiri sacara biologis per grup). 2-DG,2-deoksi-D-glukosa. Uji t Student dua sisi dianggo dina (b–h). Dina (g–i), bilah kasalahan ngagambarkeun rata-rata ± SD, unggal ékspérimén dilakukeun tilu kali sacara mandiri sareng hasilna sami. Data sumber disayogikeun dina bentuk file data sumber.
Nginget dampak anu signifikan tina parobahan métabolisme triptofan dina grup LA, kami ogé meunteun tingkat triptofan sérum dina grup HC, BN, sareng LA nganggo QQQ. Kami mendakan yén triptofan sérum turun dina LA dibandingkeun sareng HC atanapi BN (p <0,001, Gambar 5d), anu saluyu sareng panemuan sateuacana yén tingkat triptofan anu bersirkulasi langkung handap dina pasien kanker paru-paru tibatan dina kontrol séhat ti grup kontrol33,34,35. Panilitian sanés anu nganggo PET/CT tracer 11C-metil-L-triptofan mendakan yén waktos ingetan sinyal triptofan dina jaringan kanker paru-paru ningkat sacara signifikan dibandingkeun sareng lési jinak atanapi jaringan normal36. Kami ngaduga yén panurunan triptofan dina sérum LA tiasa ngagambarkeun serapan triptofan aktif ku sél kanker paru-paru.
Ogé dipikanyaho yén produk ahir tina jalur kynurenin tina katabolisme triptofan nyaéta NAD+37,38, anu mangrupikeun substrat penting pikeun réaksi gliseraldehida-3-fosfat sareng 1,3-bisfosfogliserat dina glikolisis39. Sanaos panilitian sateuacana parantos museur kana peran katabolisme triptofan dina régulasi imun, kami narékahan pikeun ngajelaskeun interaksi antara disregulasi triptofan sareng jalur glikolitik anu dititénan dina panilitian ayeuna. Anggota kulawarga transporter zat terlarut 7 5 (SLC7A5) dipikanyaho salaku transporter triptofan43,44,45. Fosforibosiltransferase asam quinolinic (QPRT) nyaéta énzim anu aya di hilir jalur kynurenin anu ngarobih asam quinolinic janten NAMN46. Inspeksi tina sét data LUAD TCGA ngungkabkeun yén duanana SLC7A5 sareng QPRT ningkat sacara signifikan dina jaringan tumor dibandingkeun sareng jaringan normal (Gambar 5e). Kanaékan ieu dititénan dina tahapan I sareng II ogé tahapan III sareng IV adenokarsinoma paru-paru (Gambar Tambahan 11), nunjukkeun gangguan awal dina métabolisme triptofan anu aya hubunganana sareng tumorigenesis.
Salian ti éta, sét data LUAD-TCGA nunjukkeun korélasi positif antara éksprési mRNA SLC7A5 sareng GAPDH dina sampel pasien kanker (r = 0,45, p = 1,55E-26, Gambar 5f). Sabalikna, teu aya korélasi anu signifikan anu kapanggih antara tanda tangan gén sapertos kitu dina jaringan paru-paru normal (r = 0,25, p = 0,06, Gambar 5f). Knockdown SLC7A5 (Gambar Tambahan 12) dina sél A549 sacara signifikan ngirangan tingkat triptofan sélular sareng NAD(H) (Gambar 5g,h), anu ngahasilkeun aktivitas glikolitik anu dilemahkeun sakumaha diukur ku laju asidifikasi ékstrasélulér (ECAR) (Gambar 1). 5i). Ku kituna, dumasar kana parobahan métabolik dina sérum sareng deteksi in vitro, urang hipotésis yén métabolisme triptofan tiasa ngahasilkeun NAD+ ngaliwatan jalur kynurenine sareng maénkeun peran penting dina ngamajukeun glikolisis dina kanker paru-paru.
Panilitian nunjukkeun yén sajumlah ageung nodul pulmonal anu teu ditangtukeun anu dideteksi ku LDCT tiasa nyababkeun kabutuhan tés tambahan sapertos PET-CT, biopsi paru-paru, sareng perawatan anu kaleuleuwihi kusabab diagnosis malignansi anu positif palsu.31 Sakumaha anu dipidangkeun dina Gambar 6, panilitian kami ngaidentipikasi panel metabolit sérum kalayan nilai diagnostik poténsial anu tiasa ningkatkeun stratifikasi résiko sareng manajemen nodul pulmonal salajengna anu dideteksi ku CT.
Nodul pulmonal dievaluasi nganggo tomografi komputer dosis rendah (LDCT) kalayan fitur pencitraan anu nunjukkeun panyabab jinak atanapi ganas. Hasil nodul anu teu pasti tiasa nyababkeun kunjungan tindak lanjut anu sering, intervensi anu teu perlu, sareng perawatan anu kaleuleuwihi. Dilebetkeunna klasifikasi métabolik sérum kalayan nilai diagnostik tiasa ningkatkeun penilaian résiko sareng manajemen nodul pulmonal salajengna. Tomografi émisi positron PET.
Data tina panilitian NLST AS sareng panilitian NELSON Éropa nunjukkeun yén panyaringan kelompok résiko tinggi nganggo tomografi komputer dosis rendah (LDCT) tiasa ngirangan mortalitas kanker paru-paru1,3. Nanging, penilaian résiko sareng manajemen klinis salajengna tina sajumlah ageung nodul pulmonal insidental anu dideteksi ku LDCT tetep janten anu paling nangtang. Tujuan utama nyaéta pikeun ngaoptimalkeun klasifikasi anu leres tina protokol berbasis LDCT anu tos aya ku cara ngagabungkeun biomarker anu tiasa dipercaya.
Biomarker molekuler tangtu, sapertos metabolit getih, parantos diidéntifikasi ku cara ngabandingkeun kanker paru-paru sareng kontrol anu séhat15,17. Dina panilitian ayeuna, urang fokus kana aplikasi analisis metabolomik sérum pikeun ngabédakeun antara nodul pulmonal jinak sareng ganas anu sacara teu dihaja dideteksi ku LDCT. Urang ngabandingkeun metabolit sérum global kontrol séhat (HC), nodul paru-paru jinak (BN), sareng sampel adenokarsinoma paru-paru (LA) stadium I nganggo analisis UPLC-HRMS. Urang mendakan yén HC sareng BN gaduh profil métabolik anu sami, sedengkeun LA nunjukkeun parobihan anu signifikan dibandingkeun sareng HC sareng BN. Urang ngaidentipikasi dua sét metabolit sérum anu ngabédakeun LA tina HC sareng BN.
Skéma idéntifikasi dumasar LDCT ayeuna pikeun nodul jinak sareng ganas utamina dumasar kana ukuran, kapadetan, morfologi sareng laju kamekaran nodul kana waktosna30. Panilitian sateuacana parantos nunjukkeun yén ukuran nodul raket patalina sareng kamungkinan kanker paru-paru. Bahkan dina pasien résiko tinggi, résiko malignansi dina nodul <6 mm nyaéta <1%. Résiko malignansi pikeun nodul anu ukuranana 6 dugi ka 20 mm kisaran ti 8% dugi ka 64%30. Ku alatan éta, Fleischner Society nyarankeun diaméter cutoff 6 mm pikeun tindak lanjut CT rutin.29 Nanging, penilaian résiko sareng manajemen nodul pulmonal indeterminate (IPN) anu langkung ageung tibatan 6 mm teu acan dilaksanakeun sacara nyukupan31. Manajemen panyakit jantung bawaan ayeuna biasana dumasar kana ngantosan anu ati-ati kalayan pemantauan CT anu sering.
Dumasar kana métabolom anu divalidasi, kami nunjukkeun pikeun kahiji kalina tumpang tindihna tanda tangan métabolom antara individu anu séhat sareng nodul jinak <6 mm. Kamiripan biologis ieu saluyu sareng panemuan CT sateuacana yén résiko malignansi pikeun nodul <6 mm sami rendahna sareng subjek anu henteu gaduh nodul.30 Perlu dicatet yén hasil kami ogé nunjukkeun yén nodul jinak <6 mm sareng ≥6 mm gaduh kamiripan anu luhur dina profil métabolom, nunjukkeun yén definisi fungsional étiologi jinak konsisten henteu paduli ukuran nodul. Ku kituna, panel métabolit sérum diagnostik modéren tiasa nyayogikeun hiji uji salaku tés aturan-kaluar nalika nodul mimitina dideteksi dina CT sareng berpotensi ngirangan pemantauan serial. Dina waktos anu sami, panel biomarker métabolik anu sami ngabédakeun nodul ganas ukuran ≥6 mm tina nodul jinak sareng nyayogikeun prediksi anu akurat pikeun IPN anu ukuranana sami sareng fitur morfologis anu ambigu dina gambar CT. Klasifikasi métabolisme sérum ieu hasil kalayan saé dina ngaramal malignansi nodul ≥6 mm kalayan AUC 0,927. Sacara gembleng, hasil panalungtikan nunjukkeun yén tanda métabolik sérum anu unik tiasa sacara khusus ngagambarkeun parobahan métabolik awal anu diinduksi tumor sareng gaduh nilai poténsial salaku prediktor résiko, henteu gumantung kana ukuran nodul.
Anu penting, adenokarsinoma paru-paru (LUAD) sareng karsinoma sél skuamosa (LUSC) mangrupikeun jinis utama kanker paru-paru non-sél leutik (NSCLC). Kusabab LUSC aya hubunganana pisan sareng panggunaan bako47 sareng LUAD mangrupikeun histologi anu paling umum tina nodul paru-paru insidental anu dideteksi dina skrining CT48, modél klasifikasi kami khusus diwangun pikeun sampel adenokarsinoma stadium I. Wang sareng kolega ogé fokus kana LUAD sareng ngaidentipikasi salapan tanda tangan lipid nganggo lipidomik pikeun ngabédakeun kanker paru-paru stadium awal ti individu anu séhat17. Kami nguji modél klasifikasi ayeuna dina 16 kasus LUSC stadium I sareng 74 nodul jinak sareng niténan akurasi prediksi LUSC anu handap (AUC 0,776), nunjukkeun yén LUAD sareng LUSC tiasa gaduh tanda tangan métabolom sorangan. Memang, LUAD sareng LUSC parantos dipidangkeun béda dina étiologi, asal biologis sareng aberasi genetik49. Ku alatan éta, jinis histologi sanés kedah dilebetkeun kana modél pelatihan pikeun deteksi kanker paru-paru dumasar populasi dina program skrining.
Di dieu, urang ngaidentipikasi genep jalur anu paling sering robih dina adenokarsinoma paru-paru dibandingkeun sareng kontrol séhat sareng nodul jinak. Xantin sareng hipoksantin mangrupikeun metabolit umum tina jalur métabolik purin. Saluyu sareng hasil urang, zat antara anu aya hubunganana sareng métabolisme purin ningkat sacara signifikan dina sérum atanapi jaringan pasien anu ngagaduhan adenokarsinoma paru-paru dibandingkeun sareng kontrol séhat atanapi pasien dina tahap pra-invasif15,50. Kadar xantin sareng hipoksantin sérum anu ningkat tiasa ngagambarkeun anabolisme anu diperyogikeun ku sél kanker anu gancang proliferasi. Disregulasi métabolisme glukosa mangrupikeun ciri khas métabolisme kanker51. Di dieu, urang niténan paningkatan anu signifikan dina piruvat sareng laktat dina grup LA dibandingkeun sareng grup HC sareng BN, anu saluyu sareng laporan sateuacana ngeunaan abnormalitas jalur glikolitik dina profil métabolom sérum pasien kanker paru-paru non-sél leutik (NSCLC) sareng kontrol séhat. hasilna konsisten52,53.
Anu penting, urang niténan korélasi tibalik antara métabolisme piruvat sareng triptofan dina sérum adenokarsinoma paru-paru. Kadar triptofan sérum turun dina grup LA dibandingkeun sareng grup HC atanapi BN. Anu pikaresepeun, panilitian skala ageung sateuacana anu nganggo kohort prospektif mendakan yén kadar triptofan anu sirkulasina handap aya hubunganana sareng ningkatna résiko kanker paru-paru 54. Triptofan mangrupikeun asam amino ésénsial anu urang kéngingkeun sapinuhna tina tuangeun. Urang nyimpulkeun yén panurunan triptofan sérum dina adenokarsinoma paru-paru tiasa ngagambarkeun panurunan gancang metabolit ieu. Éta dipikanyaho sacara umum yén produk ahir katabolisme triptofan ngalangkungan jalur kynurenine mangrupikeun sumber sintésis NAD+ de novo. Kusabab NAD+ dihasilkeun utamina ngalangkungan jalur salvage, pentingna NAD+ dina métabolisme triptofan dina kaséhatan sareng panyakit masih kedah ditangtukeun46. Analisis kami ngeunaan database TCGA nunjukkeun yén éksprési transporter triptofan solute transporter 7A5 (SLC7A5) ningkat sacara signifikan dina adenokarsinoma paru-paru dibandingkeun sareng kontrol normal sareng berkorelasi positif sareng éksprési énzim glikolitik GAPDH. Panilitian sateuacana utamina museur kana peran katabolisme triptofan dina ngurangan réspon imun antitumor40,41,42. Di dieu kami nunjukkeun yén inhibisi serapan triptofan ku cara knockdown SLC7A5 dina sél kanker paru-paru nyababkeun panurunan salajengna dina tingkat NAD sélular sareng atenuasi aktivitas glikolitik. Singkatna, panilitian kami nyayogikeun dasar biologis pikeun parobahan dina métabolisme sérum anu aya hubunganana sareng transformasi ganas adenokarsinoma paru-paru.
Mutasi EGFR mangrupikeun mutasi pendorong anu paling umum dina pasien NSCLC. Dina panilitian kami, kami mendakan yén pasien anu ngagaduhan mutasi EGFR (n = 41) ngagaduhan profil métabolik sacara umum sami sareng pasien anu ngagaduhan EGFR tipe liar (n = 31), sanaos kami mendakan tingkat sérum anu turun tina sababaraha pasien mutan EGFR dina pasien asilkarnitin. Fungsi anu ditetepkeun tina asilkarnitin nyaéta pikeun ngangkut gugus asil tina sitoplasma kana matriks mitokondria, anu ngarah kana oksidasi asam lemak pikeun ngahasilkeun énergi 55. Saluyu sareng panemuan kami, panilitian anyar ogé ngaidentipikasi profil métabolom anu sami antara tumor mutan EGFR sareng tipe liar EGFR ku cara nganalisis métabolom global tina 102 sampel jaringan adenokarsinoma paru-paru 50. Anu pikaresepeun, eusi asilkarnitin ogé kapendak dina grup mutan EGFR. Ku alatan éta, naha parobahan dina tingkat asilkarnitin ngagambarkeun parobahan métabolik anu diinduksi EGFR sareng jalur molekuler anu mendasari tiasa pantes dikaji langkung lanjut.
Dina kacindekanana, panilitian kami netepkeun klasifikasi métabolik sérum pikeun diagnosis diferensial nodul pulmonal sareng ngajukeun alur kerja anu tiasa ngaoptimalkeun penilaian résiko sareng ngagampangkeun manajemen klinis dumasar kana panyaringan CT scan.
Panilitian ieu disatujuan ku Komite Étika Rumah Sakit Kanker Universitas Sun Yat-sen, Rumah Sakit Afiliasi Kahiji Universitas Sun Yat-sen, sareng Komite Étika Rumah Sakit Kanker Universitas Zhengzhou. Dina grup panemuan sareng validasi internal, 174 séra ti jalma séhat sareng 244 séra ti nodul jinak dikumpulkeun ti jalma anu ngalaman pamariksaan médis taunan di Departemen Pengendalian sareng Pencegahan Kanker, Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen, sareng 166 nodul jinak. sérum. Adénokarsinoma paru-paru stadium I dikumpulkeun ti Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen. Dina kohort validasi éksternal, aya 48 kasus nodul jinak, 39 kasus adénokarsinoma paru-paru stadium I ti Rumah Sakit Afiliasi Kahiji Universitas Sun Yat-sen, sareng 24 kasus adénokarsinoma paru-paru stadium I ti Rumah Sakit Kanker Zhengzhou. Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen ogé ngumpulkeun 16 kasus kanker paru-paru sél skuamosa stadium I pikeun nguji kamampuan diagnostik tina klasifikasi métabolik anu ditetepkeun (karakteristik pasien dipidangkeun dina Tabel Tambahan 5). Sampel tina kohort panemuan sareng kohort validasi internal dikumpulkeun antara Januari 2018 sareng Méi 2020. Sampel pikeun kohort validasi éksternal dikumpulkeun antara Agustus 2021 sareng Oktober 2022. Pikeun ngaminimalkeun bias gender, jumlah kasus lalaki sareng awéwé anu sami ditugaskeun ka unggal kohort. Tim Panemuan sareng Tim Tinjauan Internal. Jenis kelamin pamilon ditangtukeun dumasar kana laporan diri. Persetujuan anu diinformasikeun diala ti sadaya pamilon sareng teu aya kompensasi anu disayogikeun. Subjék anu gaduh nodul jinak nyaéta anu gaduh skor CT scan anu stabil dina 2 dugi ka 5 taun dina waktos analisis, kecuali 1 kasus tina sampel validasi éksternal, anu dikumpulkeun sateuacan operasi sareng didiagnosis ku histopatologi. Kalayan pengecualian bronkitis kronis. Kasus adenokarsinoma paru-paru dikumpulkeun sateuacan réseksi paru-paru sareng dikonfirmasi ku diagnosis patologis. Sampel getih puasa dikumpulkeun dina tabung pamisahan sérum tanpa antikoagulan. Sampel getih digumpalkeun salami 1 jam dina suhu kamar teras disentrifugasi dina 2851 × g salami 10 menit dina suhu 4°C pikeun ngumpulkeun supernatan sérum. Alikuot sérum dibekukeun dina suhu -80°C nepi ka ékstraksi metabolit. Departemen Pencegahan Kanker sareng Pamariksaan Médis Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen ngumpulkeun sérum ti 100 donor séhat, kalebet lalaki sareng awéwé anu umurna 40 dugi ka 55 taun. Volume anu sami tina unggal sampel donor dicampur, hasil anu dihasilkeun dialikuot sareng disimpen dina suhu -80°C. Campuran sérum dianggo salaku bahan rujukan pikeun kontrol kualitas sareng standarisasi data.
Sérum rujukan sareng sampel tés dicairkeun teras metabolitna diekstrak nganggo metode ékstraksi gabungan (MTBE/metanol/cai) 56. Sacara singget, 50 μl sérum dicampur sareng 225 μl metanol tiis és sareng 750 μl metil tert-butil éter (MTBE) tiis és. Aduk campuran sareng inkubasi dina és salami 1 jam. Sampel teras dicampur sareng divortex dicampur sareng 188 μl cai kelas MS anu ngandung standar internal (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-métionin, sareng 13C6-isoleusin, anu dipésér ti Cambridge Isotope Laboratories). Campuran teras disentrifugasi dina 15.000 × g salami 10 menit dina suhu 4 °C, sareng fase handap dipindahkeun kana dua tabung (masing-masing 125 μL) pikeun analisis LC-MS dina modeu positif sareng négatip. Pamungkas, sampel éta diuapkeun nepi ka garing dina konsentrator vakum kecepatan tinggi.
Métabolit anu garing dilarutkeun deui dina 120 μl 80% asetonitril, divorteks salami 5 menit, teras disentrifugasi dina 15.000 × g salami 10 menit dina suhu 4°C. Supernatan dipindahkeun kana botol kaca ambar nganggo microinserts pikeun studi metabolomik. Analisis metabolomik anu teu dituju dina platform kromatografi cair ultra-kinerja-spektrometri massa résolusi tinggi (UPLC-HRMS). Métabolit dipisahkeun nganggo sistem Dionex Ultimate 3000 UPLC sareng kolom ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Dina modeu ion positif, fase gerakna nyaéta 95% (A) sareng 50% asetonitril (B), masing-masing ngandung 10 mmol/L amonium asetat sareng 0,1% asam format. Dina modeu négatif, fase gerak A sareng B masing-masing ngandung 95% sareng 50% asetonitril, duanana fase ngandung 10 mmol/L amonium asetat, pH = 9. Program gradien nyaéta sapertos kieu: 0–0,5 mnt, 2% B; 0,5–12 mnt, 2–50% B; 12–14 mnt, 50–98% B; 14–16 mnt, 98% B; 16–16,1 mnt, 98 –2% B; 16,1–20 mnt, 2% B. Kolom dijaga dina suhu 40°C sareng sampel dina suhu 10°C dina autosampler. Laju aliran nyaéta 0,3 ml/mnt, volume injeksi nyaéta 3 μl. Spektrometer massa Orbitrap Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific) kalayan sumber ionisasi éléktrospray (ESI) dioperasikeun dina modeu scan pinuh sareng digabungkeun sareng modeu monitoring ddMS2 pikeun ngumpulkeun data anu ageung. Parameter MS disetel sapertos kieu: tegangan semprot +3,8 kV/- 3,2 kV, suhu kapiler 320°C, gas pelindung 40 arb, gas bantu 10 arb, suhu pemanas probe 350°C, rentang scan 70–1050 m/ jam, résolusi 70 000. Data diala nganggo Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Pikeun meunteun kualitas data, sampel kontrol kualitas (QC) anu digabungkeun dihasilkeun ku cara miceun 10 μL alikuot supernatant tina unggal sampel. Genep suntikan sampel kontrol kualitas dianalisis dina awal runtuyan analitis pikeun meunteun stabilitas sistem UPLC-MS. Sampel kontrol kualitas teras diasupkeun sacara périodik kana bets. Sadaya 11 bets sampel sérum dina panilitian ieu dianalisis ku LC-MS. Alikuot campuran balong sérum tina 100 donor séhat dianggo salaku bahan rujukan dina bets masing-masing pikeun ngawas prosés ékstraksi sareng nyaluyukeun épék bets-ka-bets. Analisis métabolomika anu teu dituju tina kohort panemuan, kohort validasi internal, sareng kohort validasi éksternal dilakukeun di Pusat Métabolomika Universitas Sun Yat-sen. Laboratorium éksternal Pusat Analisis sareng Tés Téknologi Universitas Guangdong ogé nganalisis 40 sampel tina kohort éksternal pikeun nguji kinerja modél klasifikasi.
Saatos ékstraksi sareng rékonstitusi, kuantifikasi absolut metabolit sérum diukur nganggo kromatografi cair kinerja ultra-luhur-spektrometri massa tandem (Agilent 6495 triple quadrupole) kalayan sumber ionisasi éléktrospray (ESI) dina modeu pemantauan réaksi ganda (MRM). Kolom ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) dianggo pikeun misahkeun metabolit. Fase gerak diwangun ku 90% (A) sareng 5% asetonitril (B) kalayan 10 mmol/L amonium asetat sareng larutan amonia 0,1%. Program gradiénna nyaéta sapertos kieu: 0–1,5 menit, 0% B; 1,5–6,5 menit, 0–15% B; 6,5–8 menit, 15% B; 8–8,5 menit, 15%–0% B; 8,5–11,5 menit, 0%B. Kolom dijaga dina suhu 40 °C sareng sampel dina suhu 10 °C dina autosampler. Laju aliran nyaéta 0,3 mL/mnt sareng volume injeksi nyaéta 1 μL. Parameter MS disetel sapertos kieu: tegangan kapiler ±3,5 kV, tekanan nebulizer 35 psi, aliran gas selubung 12 L/mnt, suhu gas selubung 350°C, suhu gas pangeringan 250°C, sareng aliran gas pangeringan 14 l/mnt. Konversi MRM tina triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin sareng xantin masing-masing nyaéta 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 sareng 151,0–107,9. Data dikumpulkeun nganggo Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Pikeun sampel sérum, triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin, sareng xantin diukur nganggo kurva kalibrasi larutan campuran standar. Pikeun sampel sél, eusi triptofan dinormalisasi kana standar internal sareng massa protéin sél.
Ékstraksi puncak (m/z sareng waktos ingetan (RT)) dilaksanakeun nganggo Compound Discovery 3.1 sareng TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Pikeun ngaleungitkeun béda poténsial antara bets, unggal puncak karakteristik sampel tés dibagi ku puncak karakteristik bahan rujukan tina bets anu sami pikeun kéngingkeun kaayaan relatif. Déviasi standar relatif tina standar internal sateuacan sareng saatos standarisasi dipidangkeun dina Tabel Tambahan 6. Béda antara dua kelompok dicirikeun ku laju panemuan palsu (FDR<0,05, uji pangkat Wilcoxon signed) sareng parobahan lipatan (>1,2 atanapi <0,83). Data MS atah tina fitur anu diekstrak sareng data MS anu dikoréksi sérum rujukan dipidangkeun dina Data Tambahan 1 sareng Data Tambahan 2, masing-masing. Anotasi puncak dilaksanakeun dumasar kana opat tingkat idéntifikasi anu ditetepkeun, kalebet metabolit anu diidentifikasi, sanyawa anu dianotasi sacara dugaan, kelas sanyawa anu diidentifikasi sacara dugaan, sareng sanyawa anu teu dipikanyaho 22. Dumasar kana pamilarian database dina Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), sanyawa biologis kalayan standar anu divalidasi anu cocog sareng MS/MS atanapi anotasi cocog anu pasti dina mzCloud (skor > 85) atanapi Chemspider tungtungna dipilih salaku perantara antara métabolom diferensial. Anotasi puncak pikeun unggal fitur kalebet dina Data Tambahan 3. MetaboAnalyst 5.0 dianggo pikeun analisis univariat tina jumlah metabolit anu dinormalisasi. MetaboAnalyst 5.0 ogé meunteun analisis pengayaan jalur KEGG dumasar kana métabolit anu béda sacara signifikan. Analisis komponén utama (PCA) sareng analisis diskriminan kuadrat paling saeutik parsial (PLS-DA) dianalisis nganggo pakét parangkat lunak ropls (v.1.26.4) kalayan normalisasi tumpukan sareng autoscaling. Modél biomarker métabolit optimal pikeun ngaduga malignansi nodul dihasilkeun nganggo régrési logistik binér kalayan operator penyusutan sareng seleksi absolut paling saeutik (LASSO, pakét R v.4.1-3). Kinerja modél diskriminan dina sét deteksi sareng validasi dicirikeun ku ngira-ngira AUC dumasar kana analisis ROC numutkeun pakét pROC (v.1.18.0.). Batas probabilitas optimal diala dumasar kana indéks Youden maksimum modél (sensitivitas + spésifisitas - 1). Sampel kalayan nilai kirang atanapi langkung ageung tibatan ambang batas bakal diprediksi salaku nodul jinak sareng adenokarsinoma paru-paru, masing-masing.
Sél A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) dipelak dina média F-12K anu ngandung 10% FBS. Urutan RNA hairpin pondok (shRNA) anu nargétkeun SLC7A5 sareng kontrol non-nargétkeun (NC) dilebetkeun kana véktor lentiviral pLKO.1-puro. Urutan antisense shSLC7A5 nyaéta sapertos kieu: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antibodi ka SLC7A5 (#5347) sareng tubulin (#2148) dipésér ti Cell Signaling Technology. Antibodi ka SLC7A5 sareng tubulin dianggo dina éncér 1:1000 pikeun analisis Western blot.
Tés Setrés Glikolitik Seahorse XF ngukur kadar asidifikasi ékstrasélulér (ECAR). Dina uji éta, glukosa, oligomisin A, sareng 2-DG dikaluarkeun sacara berurutan pikeun nguji kapasitas glikolitik sélulér sakumaha anu diukur ku ECAR.
Sél A549 anu ditransféksi ku kontrol non-targeting (NC) sareng shSLC7A5 (Sh1, Sh2) dilapis sapeuting dina piring diaméter 10 cm. Métabolit sél diekstrak ku 1 ml metanol cai 80% anu tiis. Sél dina larutan metanol dikerok, dikumpulkeun kana tabung anyar, teras disentrifugasi dina 15.000 × g salami 15 menit dina suhu 4°C. Kumpulkeun 800 µl supernatan sareng garingkeun nganggo konsentrator vakum kecepatan tinggi. Pelet métabolit anu garing teras dianalisis pikeun tingkat triptofan nganggo LC-MS/MS sapertos anu dijelaskeun di luhur. Tingkat NAD(H) sélular dina sél A549 (NC sareng shSLC7A5) diukur nganggo kit kolorimetri NAD+/NADH kuantitatif (#K337, BioVision) numutkeun pitunjuk produsén. Tingkat protéin diukur pikeun unggal sampel pikeun normalkeun jumlah métabolit.
Teu aya metode statistik anu dianggo pikeun nangtukeun ukuran sampel sacara awal. Panilitian metabolomik sateuacana anu ditujukeun pikeun panemuan biomarker15,18 parantos dianggap salaku patokan pikeun nangtukeun ukuran, sareng dibandingkeun sareng laporan ieu, sampel kami cekap. Teu aya sampel anu dikaluarkeun tina kohort panilitian. Sampel sérum sacara acak ditugaskeun ka grup panemuan (306 kasus, 74,6%) sareng grup validasi internal (104 kasus, 25,4%) pikeun panilitian metabolomik anu teu dituju. Kami ogé sacara acak milih 70 kasus ti unggal grup tina set panemuan pikeun panilitian metabolomik anu dituju. Para panalungtik teu acan terang kana panempatan grup salami pangumpulan sareng analisis data LC-MS. Analisis statistik data metabolomik sareng ékspérimén sél dijelaskeun dina bagian Hasil, Legenda Gambar, sareng Métode masing-masing. Kuantifikasi triptofan sélular, NADT, sareng aktivitas glikolitik dilakukeun tilu kali sacara mandiri kalayan hasil anu sami.
Kanggo inpormasi lengkep ngeunaan desain panilitian, tingali Abstrak Laporan Portofolio Alami anu aya hubunganana sareng tulisan ieu.
Data MS atah tina fitur anu diekstrak sareng data MS anu dinormalisasi tina sérum rujukan dipidangkeun dina Data Tambahan 1 sareng Data Tambahan 2, masing-masing. Anotasi puncak pikeun fitur diferensial dipidangkeun dina Data Tambahan 3. Set data LUAD TCGA tiasa diunduh ti https://portal.gdc.cancer.gov/. Data input pikeun ngaplot grafik disayogikeun dina data sumber. Data sumber disayogikeun pikeun tulisan ieu.
Grup Studi Panyaringan Paru-paru Nasional, jsb. Ngurangan mortalitas kanker paru-paru ku tomografi komputer dosis rendah. Inggris Kalér. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR sareng Prophet, PC Skrining kanker paru-paru nganggo CT heliks dosis rendah: hasil tina National Lung Screening Study (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Ngurangan mortalitas kanker paru-paru ku skrining CT volumetrik dina uji coba acak. Inggris Kalér. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Waktos posting: 18-Sep-2023